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目的干燥综合征(Sj?gren’s syndrome,SS)是一种慢性自身免疫性干眼类型,主要侵犯唾液腺和泪腺,表现为口、眼干燥,病情严重者可最终丧失功能视力,极大的影响人们的生活质量。SS发病机制尚未完全明确,目前仍缺乏有效的治疗方法。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是来源于中胚层的多能干细胞,具有低免疫原性及免疫抑制特性,已用于系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)、类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis)等多种自身免疫性疾病的临床治疗。近年大量研究表明,过表达白细胞介素10(interleukin10,IL-10)基因可显著增强MSCs对疾病的治疗效能,为难治性自身免疫性疾病的治疗带来了新的转机,但应用慢病毒介导IL-10基因感染MSCs对自身免疫性干眼的免疫调节机制研究尚未见报道。本研究将通过兔抗原T细胞诱导的自身免疫性干眼模型,探究发病早期静脉输注IL-10-ADSCs对干眼发病进程的影响,并初步探索IL-10-ADSCs在自身免疫性干眼中的免疫调节机理,为自身免疫性干眼的防治提供新的干预策略和实验依据。方法1.构建IL-10基因修饰的兔ADSCs及鉴定:构建并制备携载IL-10基因的慢病毒载体及空载对照载体并进行慢病毒的包装,分离培养原代兔ADSCs,运用包装好的携带IL-10目的基因的病毒颗粒及对照空载病毒颗粒对ADSCs进行体外感染,Q-PCR及Western blot检测IL-10-ADSCs细胞中IL-10基因mRNA及蛋白过表达水平,RT-PCR验证IL-10-ADSCs的干细胞特性。2.发病早期输注IL-10-ADSCs对兔自身免疫性干眼的治疗作用:建立T细胞诱导的兔自身免疫性干眼模型,将动物随机分组为模型组、ADSCs干预组和IL-10-ADSCs干预组,分别于造模后次日自耳缘静脉输注PBS、ADSCs或IL-10-ADSCs,隔日输注一次,共进行5次输注。分别于造模前及造模后2、4、6、8周观察各组兔子干眼相关临床指标(泪液分泌量、泪膜破裂时间及角膜荧光素钠染色)。8周后处死兔子,取材进行病理学HE染色,观察各组兔子泪腺及结膜组织中淋巴细胞浸润情况。3.IL-10-ADSCs对兔自身免疫性干眼免疫调控机制的研究。Q-PCR检测各组兔子泪腺组织中Th17细胞相关细胞因子IL-17和转录因子RORC的表达水平。分离培养兔泪腺上皮细胞及自体外周血淋巴细胞建立淋巴细胞体外激活共培养体系,分组按PBMCs:ADSCs为5:1的比例加入等量ADSCs、IL-10-ADSCs及GFP-ADSCs,同时以等比例的成人真皮成纤维细胞HDF-α(human dermal fibroblasts-α,HDF-α)作为对照组,Q-PCR检测各组细胞Th17细胞相关基因及其分化相关细胞因子mRNA表达水平。结果1.成功构建携载IL-10基因的慢病毒载体,与包装质粒pMD2.G及pSPAX2共转染人胚肾293T细胞,收集提纯慢病毒颗粒。将包装好的携带IL-10目的基因的慢病毒颗粒及空载病毒颗粒对ADSCs进行体外感染,成功构建IL-10-ADSCs和GFP-ADSCs。流式细胞仪检测绿色荧光蛋白表达率达80%以上,Q-PCR及Western blot检测结果显示,IL-10-ADSCs组IL-10基因mRNA及蛋白表达水平均高于对照组GFP-ADSCs(IL-10-ADSCs组:2.79±0.69;GFP-ADSCs组:1.00±0.37,P<0.05),差异有统计学意义。2.成功构建兔自身免疫性干眼模型,发病早期静脉输注IL-10-ADSCs可有效延缓兔自身免疫性干眼发病进程,与模型组相比,ADSCs干预组和IL-10-ADSCs干预组均可缓解自身免疫性干眼相关临床体征,降低泪腺及结膜组织中淋巴细胞浸润程度,且IL-10-ADSCs效果进一步加强。3.IL-10-ADSCs对兔自身免疫性干眼免疫调控作用研究结果表明,IL-10-ADSCs静脉输注可显著降低泪腺组织中Th17细胞相关细胞因子IL-17及转录因子RORC的表达水平,较ADSCs干预组降低效果进一步加强。体外探究IL-10-ADSCs对兔外周血Th17细胞分化相关基因表达的调控,结果表明,与对照组HDF-α相比,ADSCs组、IL-10-ADSCs组及GFP-ADSCs组均可降低兔外周血Th17细胞相关基因mRNA表达水平,且IL-10-ADSCs组对IL-17、RORC、IL-1β及TGF-β的降低效果较ADSCs组及GFP-ADSCs组进一步加强。结论慢病毒载体可有效介导ADSCs过表达IL-10基因,且不影响其干细胞特性。疾病早期耳缘静脉输注IL-10-ADSCs可有效延缓兔自身免疫性干眼的发病进程,且与ADSCs相比效果进一步加强。IL-10-ADSCs可有效降低泪腺组织中Th17细胞相关细胞因子IL-17和转录因子RORC的表达水平。在体外,IL-10-ADSCs可抑制淋巴细胞混合培养体系中Th17细胞相关基因及免疫微环境中Th17细胞分化相关基因mRNA表达水平。因此,IL-10-ADSCs可能通过抑制Th17细胞免疫反应延缓兔自身免疫性干眼发病进程。