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背景:HIV引起的艾滋病(AIDS)自被发现以来,一直严重威胁着人类的健康,目前无有效的预防措施,抗HIV药价格昂贵,易引起不良反应,疗效也不尽人意。近年来,活病毒载体疫苗的研究受到了越来越多的重视,HIV-1的gp120基因一直是艾滋病疫苗研究的重点。缺陷性脊髓灰质炎病毒可诱导系统性的体液免疫、细胞免疫和肠道粘膜免疫,缺失P1区蛋白编码序列的脊髓灰质炎病毒突变体能自我复制,且其质量、安全检测手段已经完善建立。因而应用缺陷性脊髓灰质炎病毒表达载体构建含HIV-1gp120基因重组疫苗有很大的应用前景,目前国内还未见用脊髓灰质炎病毒表达载体构建HIV重组疫苗的正式报道。目的:为有效的控制艾滋病的流行,为进一步研究预防性或治疗性的HIV疫苗提供实验基础。本研究以pT7gp120基因为模板,缺陷性脊髓灰质炎病毒为载体,构建含HIV-1gp120基因抗原决定簇的重组缺陷脊髓灰质炎病毒,并研究其表达、形态及遗传稳定性。方法:1、构建重组HIV-1gp120基因脊髓灰质炎病毒表达载体:选择了中国HIV-1B亚型代表毒株,以质粒pT7gp120为模板,缺陷性脊髓灰质炎病毒为载体,构建含HIV-1gp120基因抗原决定簇的重组缺陷脊髓灰质炎病毒,并通过PCR、酶切鉴定证实HIV-1gp120基因片段是否正确的插入到脊髓灰质炎病毒载体。2、HIV-1 gp120基因的表达的检测:1)用脂质体转染技术将重组质粒转染Hela细胞,用G418试剂对转染后的细胞进行压力筛选,得到转入重组脊髓灰质炎病毒表达载体的细胞株Hela-gp120,通过RT-PCR检测混合细胞系中HIV-1gp120基因的表达,鉴定是否有目的基因的插入;2)通过免疫酶法检测混合细胞系中HIV-1 gp120基因的表达,检测到是否有目的基因的表达;3)将重组病毒感染293细胞,经过Western blot方法检测重组缺陷脊髓灰质炎病毒是否能感染细胞并表达目的基因片段的蛋白产物。3、重组HIV-1gp120基因脊髓灰质炎病毒形态观察:通过重组痘苗病毒提供缺陷脊髓灰质炎病毒的衣壳蛋白,组装重组脊髓灰质炎病毒完整颗粒,并通过氯仿-PEG/NaCl-氯仿三步法纯化重组脊髓灰质炎病毒,电镜下观察重组病毒形态。4、重组HIV-1gp120基因脊髓灰质炎病毒安全性及遗传稳定性观察:将重组脊髓灰质炎病毒感染的293细胞继续培养传代检测疫苗的安全性及遗传稳定性。结果:1、构建重组HIV-1gp120基因脊髓灰质炎病毒通过PCR,酶切鉴定证实HIV-1gp120基因片段正确的插入到脊髓灰质炎病毒载体。2、用脂质体转染技术获得的细胞株Hela-gp120,1)RT-PCR检测混合细胞系中HIV-1 gp120基因的表达,鉴定有目的基因的插入;2)通过免疫酶法检测混合细胞系中HIV-1 gp120基因的表达,检测到有目的基因的表达;3)将重组病毒感染293细胞,经过Western blot方法检测重组缺陷脊髓灰质炎病毒能感染细胞并表达目的基因。3、电镜下观察重组病毒颗粒呈直径20-30nm的对称二十面体,具有典型的脊髓灰质炎病毒颗粒形态。4、重组脊髓灰质炎病毒疫苗具有安全性及遗传稳定性。结论:1、成功构建了含HIV-1gp120基因片段重组脊髓灰质炎病毒,且能在体外表达HIV-1gp120基因片段;2、构建的含HIV-1gp120基因片段重组脊髓灰质炎病毒,形态呈直径20-30nm的对称二十面体,具有典型的脊髓灰质炎病毒颗粒形态;能够感染293细胞,并具有遗传稳定性。3、本研究为深入研究含HIV-1 gp120基因片段重组脊髓灰质炎病毒的免疫原性,以及其能诱导出强大的体液免疫和细胞免疫打下了基础,为更好的防治HIV的感染提供了实验室基础。