【摘 要】
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D-阿洛酮糖是一种高甜度低卡路里的稀少糖,它是D-果糖C-3位点处对应的差向异构体。D-阿洛酮糖具有调节脂质代谢、维持血糖水平、抗肥胖等功效,是当下最有潜力的甜味剂之一,在医药、食品等领域具有广阔的应用前景。目前,D-阿洛酮糖的主要生产方式是通过D-阿洛酮糖3-差向异构酶（D-allulose 3-epimerase,DAEase）催化以D-果糖为底物的差向异构反应来合成。然而,DAEase较差的
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D-阿洛酮糖是一种高甜度低卡路里的稀少糖,它是D-果糖C-3位点处对应的差向异构体。D-阿洛酮糖具有调节脂质代谢、维持血糖水平、抗肥胖等功效,是当下最有潜力的甜味剂之一,在医药、食品等领域具有广阔的应用前景。目前,D-阿洛酮糖的主要生产方式是通过D-阿洛酮糖3-差向异构酶（D-allulose 3-epimerase,DAEase）催化以D-果糖为底物的差向异构反应来合成。然而,DAEase较差的热稳定性以及低重复利用性限制了其工业化应用。本研究从Clostridium cellulolyticum H10来源的DAEase（CcDAEase）出发,利用定向进化技术获得酶活与热稳定性提高的优势突变体,并将突变位点进行叠加构建热稳定性进一步提高的叠加突变体;随后测定叠加突变体的酶学性质以及对D-果糖的转化率;最终将热稳定性最佳的突变体在Bacillus subtilis中进行重组表达并进行全细胞固定化研究,逐步提升CcDAEase的工业化应用潜力。本论文主要研究内容如下:（1）定向进化提高CcDAEase的酶活及热稳定性。构建基于转录因子PsiR的生物传感器并从培养基组分、筛选质粒稳定性等方面进行筛选条件优化,结合流式细胞分选技术与微孔板筛选法进行CcDAEase突变体文库的超高通量筛选,获得热稳定性明显提高的三个突变体T119K、D281G和C289R。（2）突变体的酶学定性及构效关系解析。分别测定突变体T119K、D281G和C289R的酶学性质,其中D281G和C289R的最适反应温度(Topt)均为70℃,较野生型提高了5℃,且在65℃下的半衰期(t1/2)分别是野生型的13.80倍和13.88倍。通过蛋白结构预测与分子动力学模拟发现形成亚基内/间氢键或盐桥、α4-β4间loop区以及C末端刚性增强、表面电荷分布优化以及静电斥力减弱可能是突变体热稳定性提高的原因。（3）构建热稳定性提高的叠加突变体。将热稳定性提高的D281G、C289R和T119K进行叠加组合,构建叠加突变体T119K/D281G/C289R。T119K/D281G/C289R的Topt为65℃,解折叠温度（Tm）与野生型比提高了14.36℃,且65℃下的t1/2是野生型的82.14倍。同时将D281G和C289R与实验室前期筛选到的比活提高但热稳定性降低的突变体H207L进行叠加组合,构建突变体H207L/D281G/C289R。H207L/D281G/C289R的比活力是野生型的2.24倍,Topt为65℃,Tm较野生型提高了11.48℃,在65℃下的t1/2值是野生型的23.80倍。以上实验结果说明D281G和C289R对提高热稳性有正向作用。（4）T119K/D281G/C289R在B.subtilis中的重组表达及全细胞固定化研究。构建重组质粒pHY300PLK-Δ109-T119K/D281G/C289R并转化至B.subtilis WS9、WHS9、WS11,测定CcDAEase在不同宿主内的表达情况。重组菌B.subtilis WHS9/pHY300PLK-Δ109-T119K/D281G/C289R的发酵酶活最高,是对照菌B.subtilis WS11/pHY300PLK-Δ109-ccdae酶活的3.26倍。使用水性聚氨酯-硅藻土（包埋-吸附法）对CcDAEase进行全细胞固定化,最优固定化条件为:水性聚氨酯与细胞的质量比为1:1,40μm硅藻土的添加量为5 g·L-1,酶转化体系内固定化细胞添加量为50 g·L-1,摇床转速为50 r·min-1。固定化细胞在80℃,pH 7.5的反应条件下活性最高,Topt较未固定化细胞提高了10℃,重复利用64次后转化率仍能够维持在最高转化率的80%。
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