论文部分内容阅读
p-内酰胺类药物是发现最早、应用最广的一大类抗生素,临床常用于预防和治疗动物疾病。长期滥用及不合理使用此类药物易造成动物体内药物残留,由此产生的食品安全问题已引起国内外普遍关注。亟需发展快速、可靠、高效的检测方法来监控动物源食品此类药物残留,从而保障食品安全和人类健康。目前,基于抗体建立的β-内酰胺类检测方法往往只能检测一种或少数几种结构相似的药物。青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins,PBPs)可以特异性识别这类药物,已成为β-内酰胺类药物残留检测方法研究的热点。本研究基于肺炎链球菌R6的PBP3蛋白建立了牛奶中p-内酰胺类药物残留快速检测方法,并通过分子对接和定点突变技术对PBP3蛋白结构进行初步研究。体外扩增pbp3基因,构建表达载体pET28b-pbp3,获得N端带6×His融合标签的重组蛋白PBP3。优化诱导表达条件,在0.2mM异丙基-p-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside,IPTG)、20℃下诱导16h时,重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内实现高效表达。采用Ni-NTA亲和层析纯化,可溶性表达效率约为3mg/100mL。重组蛋白PBP3可以特异性识别p-内酰胺类药物,与药物结合能力受缓冲液pH值、离子强度及有机溶剂影响较大。采用乙基二甲氨基碳化二亚胺法(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide,EDC)将5种p-内酰胺类药物与辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)偶联,获得5种酶标记物,其中氨苄西林(Ampicillin, AMP)偶联酶标物AMP-HRP与PBP3结合能力最强。以PBP3和AMP-HRP酶标物组合建立牛奶中27种p-内酰胺类药物多残留微孔板检测方法,并对检测体系进行优化。优化后检测限(LOD)为0.26-109.46ng mL-1, IC50为1.83-426.02ng mL-1,除了头孢哌酮,其他药物检测限均低于欧盟最高残留限量(Maximum Residues Limits,MRLs)。在空白纯牛奶和脱脂奶中添加11种β-内酰胺类药物,添加回收率分别为63.97%-107.26%和74.06%-106.31%,变异系数均低于16%。本研究利用Surflex X-2.0将PBP3与12种p-内酰胺类药物进行分子对接。氢键和疏水作用力是主要作用力。除了先前报道的关键氨基酸外,还发现5个出现频率较高的氨基酸残基Ser97、 Asn163、Thr166、Thr243、Asp244参与氢键和活性口袋的形成,在PBP3蛋白与药物互作模式中发挥重要作用。对接过程中药物小分子侧链大小及结构影响了其与靶蛋白几何匹配和结合能量的变化,从而导致亲和力差异。通过在PBP3蛋白特定位置引入二硫键,构建获得5个突变体,其亲和力和稳定性均发生变化。其中,A353C/E393C突变体在亲和力不受影响的同时,热稳定性有所提高。结果表明,PBP3蛋白非活性中心的C端柔性区可能是影响其稳定性的重要因素,对后续PBP3蛋白的体外改造研究具有一定的参考意义。