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目的
1、应用柱层析法,制备氧化型甘露聚糖化合物,用化学方法将其与肿瘤细胞抗原相连接,为下一步作为糖基化肿瘤细胞抗原致敏DC做好准备。
2、通过观察糖基化抗原负载DC后的细胞形态、表型、细胞因子分泌以及诱导T淋巴细胞增殖情况,探讨糖基化抗原对DC生物学功能的影响。
3、通过检测糖基化抗原负载DC后激活的CTL对肿瘤细胞的杀伤率的影响,评价DC负载糖基化抗原后诱导的抗肿瘤免疫效果情况。
方法
1、4%多聚甲醛分别固定肺癌A549细胞(fixedA549,f-A)和氧化型甘露聚糖修饰的肺癌A549细胞(ox-M-A)获得两组肿瘤细胞抗原,分别定义为对照组和实验组。
2、取患者外周血分离单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC),联合应用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素-4和重组人肿瘤坏死因子-α,诱导其为成熟树突状细胞(maturedendriticcells,mDC),使其分别负载两组肿瘤细胞抗原。
3、用倒置显微镜观察实验组和对照组DC形态上的变化。
4、用流式细胞术检测实验组与对照组DC表面CD80、CD83、CD86及HLA-DR的免疫表型的变化。
5、用ELISA法检测实验组与对照组DC培养上清液中IL-12p70分泌水平。
6、CCK8法检测实验组与对照组DC激活CTL对肿瘤细胞的杀伤活性的改变。
结果
1、获得了氧化型甘露聚糖修饰的肿瘤细胞抗原的复合物,与未修饰组形成对比。
2、倒置显微镜下观察,实验组与对照组比较,实验组的DC细胞在细胞形态上有更多的树突状/伪足状突起。
3、流式细胞仪检测实验组与对照组比较,DC表面CD80、CD83、CD86及HLA-DR的表达上调较明显(76.48%vs24.90%,75.15%vs25.26%,80.20%vs31.80%,88.71%vs41.64%,P＜0.05)。
4、用ELISA法检测实验组与对照组DC培养上清液中IL-12p70分泌水平升高(41.15±2.31vs34.04±3.03,P＜0.05)。
5、CCK8法检测实验组与对照组比较,前者DC激活CTL对肿瘤细胞的杀伤活性更强(P＜0.05)。
结论
1、氧化型甘露聚糖修饰的肺癌A549肿瘤细胞抗原形成复合物后,可以增强DC细胞的抗原摄取效率在实验中得到了证实。
2、氧化型甘露聚糖修饰的肺癌A549肿瘤细胞抗原致敏DC后,可上调DC表面分子表达水平、促进细胞因子的分泌,并有效的诱导T淋巴细胞的增殖。
3、氧化型甘露聚糖修饰的肺癌A549肿瘤细胞抗原致敏DC后,诱导的CTL杀伤肿瘤细胞的能力增强。