论文部分内容阅读
目的：将miRNA靶向沉默MTDH基因的重组质粒稳定转染入人乳腺癌MDA-MB-231细胞，建立稳定不表达MTDH基因的新乳腺癌细胞株。观察稳定转染后MDA-MB-231细胞的增殖及侵袭能力的变化，为进一步深入研究MTDH基因在乳腺癌中的功能作用及其机制奠定基础，并为后续体内实验提供细胞模型,及为miRNA-MTDH靶向治疗乳腺癌提供实验依据。方法：一、MTDH基因沉默重组质粒稳定转染MDA-MB-231细胞株的建立1.细胞稳定转染：将miRNA靶向沉默MTDH基因的重组质粒pcDNA-6.2GW/Em-GFPmiR-MTDH（简称miRNA-MTDH）大量提纯。通过脂质体介导的方法将miRNA-MTDH转染入人乳腺癌MDA-MB-231细胞，经杀稻瘟菌素加压筛选4-5周，得到稳定不表达MTDH基因的新乳腺癌细胞株（命名为MDA-MB-231/P）。设立阴性质粒稳定转染的MDA-MB-231细胞株为对照（命名为MDA-MB-231/P0）。通过绿色荧光蛋白GFP检测细胞转染效率。2.稳定转染细胞株的验证：实验分组：未处理组（MDA-MB-231细胞）;对照组（MDA-MB-231/P0细胞）；干扰组（MDA-MB-231/P细胞）。采用RT-PCR、Westernblot方法分别检测三组细胞株的MTDHmRNA及MTDH蛋白表达量，以验证获得的稳定转染细胞株。二、稳定转染后细胞的体外增殖及侵袭能力的研究1.实验分组：未处理组（MDA-MB-231细胞）;对照组（MDA-MB-231/P0细胞）；干扰组（MDA-MB-231/P细胞）。2．MTT比色法绘制MDA-MB-231细胞，MDA-MB-231/P0细胞及MDA-MB-231/P细胞的生长曲线，研究比较miRNA-MTDH稳定转染后MDA-MB-231细胞的增殖能力的变化，并计算出MDA-MB-231/P细胞的增殖抑制率。3.Transwell肿瘤细胞侵袭实验检测MDA-MB-231细胞，MDA-MB-231/P0细胞及MDA-MB-231/P细胞的侵袭能力，研究比较miRNA-MTDH稳定转染后MDA-MB-231细胞的侵袭能力的变化。结果：1.提纯的miRNA-MTDH及阴性对照质粒1%琼脂糖凝胶电泳，获得约与目的大小一致的条带（约6kb）。紫外分光光度仪法测定miRNA-MTDH浓度984μg/ml，OD260/OD280值为1.956；阴性对照质粒浓度598μg/ml，OD260/OD280值为1.942。质粒提纯成功，纯度高，浓度高，可用于细胞转染。2.通过绿色荧光蛋白GFP检测，MDA-MB-231/P细胞及MDA-MB-231/P0细胞转染效率达90%。3.RT-PCR结果显示：与未处理组相比，MDA-MB-231/P细胞MTDH mRNA明显降低，下降了71.72%（P<0.05），而未处理组和对照组相比差异无显著性（P＞0.05）。4.Western blot结果显示：与未处理组相比，MDA-MB-231/P细胞MTDH蛋白的表达水平明显降低，下降了73.08%（P<0.05），而未处理组和对照组相比差异无显著性（P＞0.05）。5.MTT比色法实验结果示：未处理组，对照组及干扰组细胞生长24h后，OD值分别为1.05±0.19、1.02±0.15、0.45±0.06；48h后，OD值分别为1.07±0.08、1.07±0.09、0.47±0.07；72h后，OD值分别为1.18±0.17、1.06±0.11、0.63±0.05；96h后，OD值分别为1.28±0.15、1.21±0.08、0.69±O.O5。与未处理组相比，MDA-MB-231/P细胞在第24h，48h，72h，96h的细胞增殖抑制率分别为57.3％，56.4％，46.8％，46.4％。与未处理组相比，MDA-MB-231/P细胞增殖能力明显减弱（P<0.05），而未处理组和对照组相比差异无显著性（P＞0.05）。6. Transwell肿瘤细胞侵袭实验结果示：未处理组，对照组及干扰组三组细胞穿过基质胶的细胞数为：未处理组45.60±4.50个，对照组44.30±4.27个，干扰组8.10±1.97个。与未处理组相比，MDA-MB-231/P细胞侵袭能力明显下降（P<0.05），而未处理组和对照组相比差异无显著性（P＞0.05）。结论:1．成功建立了稳定不表达MTDH基因的人乳腺癌MDA-MB-231/P细胞株。2. miRNA靶向沉默MTDH基因的重组质粒pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-MTDH（简称miRNA-MTDH）稳定转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后可明显抑制乳腺癌细胞中MTDH的表达。3．miRNA-MTDH稳定转染可有效抑制MDA-MB-231细胞的生长增殖及侵袭能力。