研究背景结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是人类癌症相关性死亡的第二大常见原因,大约有20%的患者在确诊时就已有远处转移,在疾病进展过程中,有高达60%的患者最终会发生远处转移。血行播散是结直肠癌转移的主要方式,肿瘤细胞从原发部位脱落进入血液或淋巴系统,成为循环肿瘤细胞（circulating tumor cells,CTCs）,是肿瘤转移的关键步骤。研究显示,在肿瘤患者体内,尽管有大量的肿瘤细胞脱离原发灶至脉管系统,成为CTCs,但是绝大部分的细胞会直接死亡或发生凋亡,仅有一小部分细胞能够抵抗血流切应力和失巢凋亡的压力,最终到达靶器官,形成微转移灶。因此,研究从原发灶进入循环系统后,肿瘤细胞如何抵抗血流切应力和失巢凋亡,从而维持存活状态的分子机制,有助于我们加深对肿瘤转移过程的认识。层流切应力（laminar shear stress,LSS）是指血液流动时在血管壁或者细胞表面产生的的摩擦力,是血流动力学的重要参数。目前流体力学在肿瘤领域的研究仍有待进一步深入,在多项研究中表明LSS对循环肿瘤细胞的存活具有多种模式的调控作用。既往研究多以LSS促进肿瘤细胞死亡为主流观点,例如LSS可激活p38丝裂原活性蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases,p38MAPK）通路,引起肝癌、舌癌细胞的自噬或凋亡。然而,近期的研究却发现,相对于正常上皮细胞,前列腺癌细胞具有独特的LSS自适应性,高LSS短暂刺激前列腺癌CTCs可帮助其抵抗机械变形的压力,提高反复暴露于LSS时的存活率。另有研究表明,乳腺癌细胞表面机械敏感的泛连接蛋白1（Pannexin1,PANX1）通道可响应LSS刺激,释放细胞内三磷酸腺苷（adenosine triphophate,ATP）,通过激活嘌呤能信号通路介导肿瘤细胞在血管内的存活,提示LSS对于CTCs具有多方面的影响。CTCs的存活有利于肿瘤的远处转移,而寻找CTCs响应LSS刺激,产生抗性的分子机制,对于有效预测肿瘤进展并阻断肿瘤远处转移具有重要意义。碱性螺旋-环-螺旋（basic helic-loop-helix,-bHLH）转录因子是一类表达在真核细胞内,对细胞分化和个体发育过程有重要作用的转录因子。Atonal bHLH转录因子8（atonal bHLH transcription factor 8,ATOH8）是该转录因子家族的一员,其在肾脏、视网膜、肌肉和胰腺等组织器官发育和分化过程中发挥“允许”作用,其表达缺失可引起相应组织器官的发育障碍。目前关于ATOH8对肿瘤细胞调控作用的研究较少,且尚未见其在CTCs中的报道。有趣的是,当加载 1Odyn/cm2的LSS刺激脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUEVC）及胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC）时,可观察到ATOH8的表达上调。这提示ATOH8可能作为切应力感应分子,参与LSS调控CTCs生物表型的机械转导过程。肿瘤细胞内糖酵解是异常激活的,糖酵解可产生许多还原性代谢产物,抑制细胞内的活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,有助于肿瘤细胞抵抗LSS刺激导致的氧化应激损伤。有研究发现在循环中的慢性淋巴瘤细胞内,糖酵解进程是显著激活的,即Warburg效应,这种代谢转换能赋予循环肿瘤细胞生长优势和化学抵抗的特性,进一步提示糖酵解对于CTCs保持存活状态的重要作用。与V-Myc骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物（V-Myc Myelocytomatosis Viral Oncogene Homolog,MYC）、低氧诱导因子-1(（hypoxia inducible factor 1subunit alpha,HIF1A）等激活糖酵解进程的关键转录因子一样,ATOH8也属于bHLH转录因子家族,因此可能参与糖酵解相关基因的转录调控过程。综上,ATOH8可能通过介导糖代谢重编程,进而促进CTCs的存活。研究内容1.层流切应力感应分子ATOH8对结直肠癌CTCs存活的影响在细胞水平,分别将结肠癌细胞株LoVo、SW480置于0、5、10、20dyn/cm2大小的切应力加载装置中,然后分别利用western blotting、qRCR、免疫荧光实验对ATOH8表达量进行检测。利用慢病毒构建ATOH8过表达稳转细胞株,并对在静止状态下和切应力刺激下的细胞分别进行活细胞/死细胞染色,观察细胞存活比例。在动物水平,对BALB/c小鼠进行尾静脉注射CT26-GFP细胞后,动态观察循环系统中结肠癌细胞的存活时间和存活比例。同时,留取小鼠外周血,流式细胞术分析注射入小鼠循环系统后肿瘤细胞的凋亡比例。2.HK2在ATOH8维持结直肠癌CTCs存活的作用GSEA分析结直肠癌转移灶与原发部分的的生物学差异,同时进行后续失调代谢通路分析,通过western blotting、qPCR分析过表达或沉默ATOH8后差异表达的糖酵解基因,并最终确定己糖激酶2（hexokinase 2,HK2）作为后续研究的关键代谢基因。利用HK2酶活性检测试剂盒,检测过表达ATOH8或沉默ATOH8后HK2酶活性。为进一步探究ATOH8与HK2是否存在直接转录调控关系,利用双荧光素酶报告基因实验检测ATOH8和HK2启动子区的结合。随后,我们通过western blotting检测了过表达ATOH8后凋亡指标的表达变化。并探讨加入HK2的抑制剂2-DG和3-BrPA对循环肿瘤细胞存活的影响。3.层流切应力刺激上调ATOH8的中间环节为了探究层流切应力上调ATOH8的中间环节,使用多个切应力刺激内皮细胞后的基因芯片数据,分析在层流切应力刺激下失调的细胞因子种类。为进一步验证血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）对ATOH8表达的影响,将VEGF细胞因子与肿瘤细胞共培养,检测ATOH8的表达改变和细胞内HK2的酶活性变化,同时利用活细胞/死细胞染色试剂统计循环肿瘤细胞的凋亡比例。然后在沉默ATOH8的同时,加入VEGF共培养,检验VEGF对ATOH8表达、HK2酶活性和细胞凋亡的回复效果。4.ATOH8-VEGF促进结直肠癌CTCs存活的机制利用酶联免疫吸附实验,在过表达或沉默ATOH8后,测定肿瘤细胞培养上清中VEGF的含量改变。分别从蛋白和mRNA水平,检测过表达或沉默ATOH8后,VEGF、血管内皮细胞生长因子受体2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2,VEGFR-2）的表达改变。探讨ATOH8反馈性上调VEGF、VEGFR-2表达后,下游的磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B,PI3K/Akt）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）等通路改变情况。设计回复试验,分别加入VEGFR-2抑制剂和Akt抑制剂,观察ATOH8和HK2表达以及细胞凋亡变化的回复效果。研究结果1.层流切应力感应分子ATOH8促进结直肠CTCs存活将结肠癌细胞株LoVo、SW480分别置于0、5、10、20dyn/cm2大小的切应力加载装置中,ATOH8的表达随着切应力大小的增加逐渐升高。免疫荧光显示同样的结果。过表达ATOH8后,分别在静止状态下和切应力刺激下进行活细胞/死细胞染色,结果发现,无论是在静止状态下还是在切应力刺激下,过表达ATOH8均能显著提高肿瘤细胞的存活。动物实验中,随着时间的增加,过表达ATOH8后的CT26-GFP细胞在小鼠肺内定植的时间更长,并且其在肝脏血窦的数量多于对照组。流式细胞术结果则提示过表达ATOH8的肿瘤细胞中更少的比例发生凋亡。2.ATOH8可转录调控HK2并维持结直肠癌CTCs存活GSEA分析发现,相较于结直肠癌原发部位,转移灶肿瘤细胞的糖酵解通路被显著激活。而过表达ATOH8后,显著增强了 HK2酶活性。当使用shRNA质粒沉默ATOH8后,HK2的酶活性也随之下降。UCSC数据库查找发现,HK2启动子区第563-558碱基、第639-644碱基为E-box结构,可能为ATOH8调控HK2转录的结合区域。双荧光素酶报告基因结果显示,过表达ATOH8后,HK2荧光素酶活性表达明显增加,而将第563-558碱基缺失突变后,两组荧光素酶活性表达无明显差异。当过表达ATOH8后,促凋亡分子Bcl-2相关的X蛋白（Bcl-2-associated X protein,Bax）表达降低,抑凋亡分子B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）表达上调,而沉默ATOH8后,得到相反结果。使用HK2的抑制剂2-DG和3-BrPA后,能显著降低循环肿瘤细胞的存活率,而过表达ATOH8后则能部分回复上述结果。3.层流切应力刺激CTCs自分泌VEGF上调ATOH8表达结合多张芯片分析发现,层流切应刺激下,能上调内皮细胞的VEGF分泌。将VEGF细胞因子与肿瘤细胞共培养,肿瘤细胞ATOH8的荧光强度有显著的增强。VEGF的刺激也能增加HK2的酶活性并能减少循环肿瘤细胞的凋亡比例。回复实验中,在沉默ATOH8的同时,加入VEGF共培养,VEGF能分别回复ATOH8的表达、HK2酶活性并减少肿瘤细胞凋亡。4.ATOH8-VEGF正反馈环增强结直肠癌CTCs存活酶联免疫吸附实验结果显示,过表达ATOH8后,肿瘤细胞培养上清中VEGF的含量明显增加,同时,过表达ATOH8后,VEGF、VEGFR-2的表达明显升高,且磷酸化Akt通路被激活,而沉默ATOH8后,则能得到相反结果。使用VEGFR-2抑制剂和Akt抑制剂后,能明显抑制ATOH8和HK2的表达,并诱导细胞趋向发生凋亡,过表达ATOH8后能部分回复上述结果。研究结论LSS可通过激活“VEGF/VEGFR-2/PI3K-Akt”信号轴上调结肠癌细胞中ATOH8表达;而ATOH8上调后可转录激活HK2糖酵解信号通路,并反馈促进VEGF表达,通过正反馈调控以提高LSS促进结直肠癌细胞存活。