目的:DAPK是一种在人体组织中广泛表达的分子量为160 kDa的丝氨酸/苏氨酸激酶,在多数种类细胞中,由于DAPK与细胞的凋亡,自噬等细胞进程密切相关,在通常情况下被认为是一种肿瘤抑制分子,在多种肿瘤组织中由于DAPK基因启动子中的CpG岛的高甲基化造成了 DAPK蛋白的表达发生了下调,进而促进了肿瘤的发生发展。虽然研究人员在人透明细胞癌中也发现了 DAPK启动子的甲基化现象,但并未发现DAPK基因甲基化与DAPK的表达水平有明确的相关性,事实上,有关DAPK mRNA及DAPK蛋白在人肾透明细胞癌组织中的表达的研究有限,其表达水平目前仍不明确,此外,DAPK蛋白在肾透明细胞癌细胞中具体起到何种作用目前仍不明确。此前,有研究表明,在其他肿瘤中p53可通过转录激活DAPK基因从而上调DAPK的表达,但p53对DAPK的转录激活作用是否同样存在于肾透明细胞癌中目前仍有待验证。microRNA是一类长度约为19～22碱基的非编码小RNA,其可通过与下游靶mRNA的3’UTR结合进而抑制靶基因的翻译或促进mRNA降解,有越来越多的研究表明,microRNA通过特异性的作用于多种下游靶基因参与了肾癌的发生发展进程中,但microRNA是否参与了肾脏透明细胞癌中p53-DAPK通路的调控并影响肾脏透明细胞癌的功能目前尚不明确。本研究拟明确DAPK mRNA及DAPK蛋白在肾透明细胞癌及癌旁正常肾组织中的表达情况,并研究DAPK对肾透明细胞癌细胞凋亡,迁移及增殖的影响。此外,本实验还将进一步明确人肾透明细胞癌及细胞系中p53mRNA及p53蛋白的表达,并研究p53蛋白与DAPK表达的相关性,明确p53-DAPK通路在肾癌中是否存在作用。最后,我们还将通过生物信息学预测及实验验证的方法,找到并验证能够与p53/DAPK通路相互作用的microRNA,并通过体内体外功能实验明确该microRNA如何通过与p53/DAPK通路发生作用继而影响肾透明细胞癌功能。研究方法:我们收集了 61对肾透明细胞癌及癌旁正常肾脏组织标本,我们采用了实时定量PCR,免疫印迹法对人肾透明细胞癌及癌旁正常肾组织中的DAPK的表达进行了检测,同时,我们采用了免疫组化方法对其中的12对标本进一步检测,以明确DAPK蛋白在肾透明细胞癌及癌旁肾组织中的表达及亚细胞定位。为明确DAPK蛋白在肾透明细胞癌中起到何种作用,我们采用了 DAPK表达质粒或DAPK干扰技术对不同肾癌细胞系中DAPK蛋白进行过表达或者敲减,应用流式细胞术,细胞核染色,免疫印迹等方法检测DAPK对肾癌细胞凋亡的影响,应用CCK-8,RTCA实时无标记细胞检测,克隆形成,EdU增殖检测等体外实验明确DAPK对肾透明细胞癌增值的影响,通过裸鼠皮下成瘤的方法检测DAPK对体内细胞增殖的影响,应用细胞划痕实验,transwell等实验方法检测DAPK对细胞迁移的影响。为明确p53与DAPK在肾癌中的相关性,我们应用实时定量PCR,免疫印迹等方法检测了人肾癌组织标本中及不同肾癌细胞系中p53的表达水平及p53蛋白与DAPK蛋白表达的相关性。此外,为明确p53能否在肾透明细胞癌中转录激活DAPK,我们采用了化疗药物,p53过表达及p53通路激动剂等上调p53表达或激活p53,并检测DAPK在mRNA水平及蛋白水平的表达变化以及其他经典p53下游因子mRNA表达的变化情况。此外我们通过生物信息学预测的方法找到了可能对DAPK进行调控并受p53转录激活的microRNA,应用qPCR,免疫印迹及荧光素酶报告实验筛选并验证了三者间的相互调控作用,并进一步通过CCK-8,EDU,流式细胞术以及动物体内实验验证hsa-miR-34a-5p对肾脏透明细胞癌增殖及凋亡的影响。结果:实时定量PCR结果表明,DAPK mRNA在肾透明细胞癌中的表达低于正常肾组织(p<0.05),但在不同分级的肾透明细胞癌中其表达量无显著差异,免疫印迹实验结果表明,DAPK蛋白在G4级肾透明细胞癌中的表达低于其他分级及正常肾组织中DAPK蛋白的表达(p<0.05),但在不同分期的肾癌组织中,DAPK蛋白的表达则无显著差异,免疫组化结果提示DAPK蛋白在正常肾小管上皮及肾癌中均有表达,但在肾癌中的表达弱于正常肾小管上皮。功能学相关研究结果表明DAPK能够在不依赖p53的情况下促进肾癌细胞的凋亡,而敲减肾癌细胞系中DAPK则能够抑制肾癌细胞的凋亡,此外,体内及体外实验均表明,DAPK过表达能够抑制肾癌细胞的增殖。Transwell及细胞划痕实验则表明DAPK能够影响肾癌细胞的迁移。实时定量PCR结果提示,p53 mRNA在G1/2期及G4期肾细胞癌中的表达高于癌旁正常肾组织(p<0.05),免疫印迹实验表明,p53蛋白在T1及T3期肾癌中的表达高于正常肾组织(p<0.05),在G1/2及G3期肾癌中的表达也高于正常肾组织(p<0.05),p53蛋白在不同肾癌细胞系中也均有表达。但在肾癌标本及细胞系中p53蛋白的表达量与DAPK蛋白的表达水平无显著相关性。通过对肾癌细胞系中的p53进行干预,我们发现了 p53的激活能够促进p21,Bax等p53下游靶基因的转录上调,但却无法促进DAPK蛋白的表达上调,我们推测microRNA可能是影响p53转录激活DAPK的重要因素,我们通过生物信息学的方法预测了多个DAPK的潜在调控microRNA,并通过qRT-PCR,免疫印迹,双荧光素酶报告实验验证了 miR-34a-5p对DAPK mRNA的直接调控作用,对61例肾癌标本的检测,我们发现miR-34a-5p与DAPK蛋白在肾癌中的表达呈现负相关性。在p53激活的状态下miR-34a-5p可发生表达的上调进而抑制DAPK蛋白的翻译,并进一步抑制DAPK对细胞的促凋亡以及抑制增殖作用的发挥,而对miR-34a-5p进行抑制则能够恢复p53对DAPK蛋白的转路上调作用,进而促进p53-DAPK通路在体内体外行使促进细胞凋亡,抑制细胞增殖的作用。结论:DAPK在部分肾透明细胞癌中为低表达,其蛋白产物主要作为一种负性调节因子,能够抑制肾癌细胞的凋亡,增殖及迁移;而p53在肾透明细胞癌中则呈高表达,且由于miR-34a-5p的作用,p53无法有效上调DAPK的表达;在p53激活状态下,通过抑制miR-34a-5p的作用能够恢复p53对DAPK蛋白的上调作用进而恢复p53-DAPK通路对肾癌细胞的促凋亡及抑制增殖的作用。