布鲁氏菌病是一种再发的人兽共患传染病,近年来发病率呈逐年上升的趋势,全球每年超过500 000新增病例,我国发病人数也在逐年增长,2015年全国新增病例60 000例。布鲁氏菌病不仅会造成感染动物流产,给畜牧业带来巨大经济损失,而且会给人类的健康造成巨大危害。人类感染布鲁氏菌病后,患者会出现发热、肝脾肿大、骨关节病及血液学改变等临床症状,严重时会造成孕妇流产、新生儿死亡或者出生体重降低。对布鲁氏菌病的诊断、预防和监督已经引起世界各国的广泛重视。现有的布鲁氏菌病诊断方法或多或少存在着操作复杂、耗时长、灵敏性低、易存在交叉反应等缺点。因此寻求操作简单、快速、灵敏的诊断方法,对于布鲁氏菌病早诊断、早治疗,减少其造成的医疗负担和经济损失具有非常重要的意义。本研究拟利用免疫信息学技术,对布鲁氏菌的主要外膜蛋白进行B细胞表位预测,然后结合融合蛋白技术,将布鲁氏菌外膜蛋白的优势抗原表位进行融合,制备出能够特异性识别布鲁氏菌抗体的融合蛋白,将其作为一种新型抗原。首先,融合蛋白作为诊断抗原,建立人布鲁氏菌病间接ELISA诊断方法;其次,融合蛋白与磁性纳米粒子相偶联,利用免疫磁珠分离技术制备可特异性识别布鲁氏菌抗体的磁性纳米生物探针,联合量子点与SPA偶联所制备的量子点荧光探针,建立一种布鲁氏菌病快速诊断技术。本课题的主要研究内容包括四个部分:第一部分布鲁氏菌融合蛋白的设计与评价。1通过查阅文献,经BLAST比对分析后,成功选取了4个抗原性良好的布鲁氏菌外膜蛋白:OMP31、OMP16、OMP2b和BP26;2利用免疫信息学参数(亲水性、柔性、表面可及性、β折叠)预测和线性B细胞表位预测工具,对选取的4个外膜蛋白进行预测,成功选取了15个重叠的B细胞表位;3将预测的15个B细胞表位通过linker肽链接后,成功构建了布鲁氏菌多表位融合蛋白,该蛋白共含440个氨基酸,分子量约60 KDa,对重组融合蛋白的抗原性进行预测,结果显示该融合蛋白抗原性良好。第二部分布鲁氏菌融合蛋白的表达、纯化和评价。1利用基因工程原理,根据自主设计的融合蛋白氨基酸序列,反推密码子,并进行密码子优化,优化成适合大肠杆菌表达的密码子,人工合成融合蛋白基因,成功合成了总长度为1338bp的融合蛋白基因,并成功连接到表达载体p ET-28b,构建重组质粒,将其成功转入感受态BL21(DE3),利用大肠杆菌表达系统进行融合蛋白表达,融合蛋白表达形式为包涵体蛋白,对包涵体进行变性和复性后,联合利用镍离子亲和层析和阴离子交换层析两种常用的蛋白纯化方法,对表达后的蛋白进行纯化,纯化后的蛋白浓度达1.217 mg/m L,SDS-PAGE凝胶电泳分析其纯度大于90%;2以融合蛋白为抗原,制备疫苗,通过免疫小鼠,成功诱导小鼠产生抗体,分析血清中抗体亚型主要为Ig G,通过流式细胞仪对小鼠脾细胞中T细胞亚型分析,CD4+和CD8+的百分比及CD4+/CD8+的比值均增加,说明融合蛋白诱导小鼠产生了较强的免疫反应,融合蛋白有较好的免疫原性;3通过间接ELISA方法,融合蛋白可以识别兔抗布鲁氏菌16M血清和鸡抗布鲁氏菌16M血清,表明融合蛋白有较好的抗原性,而融合蛋白不和兔抗大肠杆菌O157:H7血清和兔抗单核细胞增生性李斯特菌血清反应,表明该融合蛋白具有一定的特异性。第三部分人布鲁氏菌病间接ELISA诊断方法的建立和评价。1利用布鲁氏菌多表位重组蛋白作为诊断抗原,建立了一种布鲁氏菌病的间接ELISA诊断方法,并优化了该间接ELISA方法的一些反应条件,包括抗原包被浓度及包被时间、封闭液种类及封闭时间、一抗稀释度及一抗孵育时间、二抗稀释度及二抗孵育时间、底物显色时间等,并对优化后的间接ELISA方法的特异性、重复性、灵敏度等进行评价,结果良好;2利用优化后的间接ELISA方法对248份血清样本进行检测,吸光度值OD450做ROC曲线分析,结果曲线下面积为0.9409,Cut-off值为0.3865,灵敏性和特异性分别为88.89%和85.54%,阳性预测值和阴性预测值分别为93.75%和89.42%。与全菌抗原比较,该融合蛋白作为诊断抗原时,诊断的灵敏性、特异性等结果均优于全菌抗原。第四部分一种布鲁氏菌病快速诊断方法的建立及评价。1利用商品化纳米磁珠和荧光量子点,分别和布鲁氏菌多表位融合蛋白、SPA偶联,优化最佳偶联率,制备出了磁纳米探针和量子点荧光探针;2利用制备的两种生物探针,建立了一种新的布鲁氏菌病诊断方法,并对该方法的各种条件进行了优化,优化后的方法仅需要100 min就可以完成诊断,与间接ELISA方法比,明显缩短了诊断时间;3利用该方法对248份血清进行了诊断,测得的荧光强度做ROC曲线分析,结果显示该方法的曲线下面积为0.970,Cut-off值为150.4,灵敏性和特异性分别为96.15%和94.12%,阳性预测值和阴性预测值分别为:95.89%和94.12%,和间接ELISA方法比较,其灵敏性、特异性、阳性预测值和阴性预测值均优于间接ELISA,该方法的诊断效果较好。综上所述,本研究利用免疫信息学技术和融合蛋白技术,构建并表达了一种布鲁氏菌多表位融合蛋白,利用该融合蛋白建立了一种灵敏特异的人布鲁氏菌病间接ELISA诊断方法,结合免疫磁珠技术和量子点标记技术,制备了一种布鲁氏菌病快速诊断方法,对于开发具有我国自主知识产权的布鲁氏菌病诊断试剂盒具有重要意义。