枇杷是一种亚热带重要水果,多在夏季高温时节成熟收获,且多数枇杷品种对高温的抵抗能力较弱,易受高温胁迫而产生“日灼”现象,严重影响经济效益。本研究用人工高温(40℃)处理不同果实发育阶段(青果期、转色期和黄熟期)的枇杷{Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.),通过测定果皮生理生化指标的变化,并利用比较蛋白质组学技术,探讨了不同发育程度的枇杷果皮对高温的分子响应机理。我们测定了高温胁迫下枇杷果皮膜透性、脯氨酸含量、MDA和H2O2含量的变化以及细胞防御和呼吸代谢相关的各种酶活性的变化,发现在高温胁迫下不同果实发育阶段的枇杷果皮中各种生理指标有不同的变化规律。同时,通过双向电泳技术共发现了高温诱导下枇杷果皮差异表达的68个蛋白,其中有36个蛋白上调,28个蛋白下调,4个蛋白不规则变化；68个蛋白中,有22个蛋白仅在青果期差异表达,35个蛋白仅在转色期差异表达,7个蛋白仅在黄熟期差异表达,2个蛋白在青果期和转色期都有差异表达,1个蛋白在转色期和黄熟期都有差异表达,1个蛋白在青果期和黄熟期都有差异表达。用MALDI-TOF-TOF/MS鉴定和数据库检索成功鉴定出55个差异表达蛋白,根据蛋白的主要生理功能分类,包括热激蛋白和分子伴侣(9%)、抵抗胁迫相关蛋白(15%)、能量代谢相关蛋白(27%)、光合作用相关蛋白(15%)、蛋白合成相关蛋白(11%)等。对关键差异表达蛋白HSP70和乙醇脱氢酶进行Western Blot分析,其结果同双向电泳结果一致,进一步证实了HSP70和乙醇脱氢酶在高温胁迫下的枇杷果皮中表达模式。本研究首次发现了不同发育阶段枇杷果皮对高温胁迫有不同的响应机制：在青果期果皮中高温诱导抗氧化类蛋白表达,增加防御相关酶的生理活性和Pro含量。该结果说明在高温胁迫下青果期果皮中各种响应胁迫的防御机制加强了运作,从而提高了果实在短期高温环境下的耐受力。在转色期果皮中,高温使MDA和H202含量上升,且高温下各种防御相关蛋白的含量和抗性酶活性没有变化或下降。同时,高温下转色期果皮中无氧呼吸和光呼吸相关酶上调。这些结果表明,高温环境下转色期果皮未能及时启动抗性酶等防御胁迫的机制,高温胁迫破坏了果皮中各种代谢的平衡,最终导致果皮中不完全氧化物等有毒物质积累,使得转色期的果实更容易受高温伤害。这些结果共同揭示了“日灼”现象易发于枇杷转色期的原因。在高温胁迫下的黄熟期枇杷果皮差异表达的蛋白较少(7个),黄熟期果皮中高温导致下调表达的蛋白包括抵御病原胁迫和清除活性氧相关蛋白、蛋白糖基化相关蛋白的,这些蛋白的表达不利于果皮细胞中保护和修复机制的正常运转。同时,高温胁迫下黄熟期果皮中的各种胁迫相关指标和抗氧化酶活性的变化未呈现出统一规律,对此还需进一步研究。总之,本研究通过观察不同发育期枇杷果皮在高温(1.5h、40℃)下诱导表达的差异蛋白组的情况,结合生理指标进行分析,较为全面地概括出了三个发育阶段(青果期,转色期,黄熟期)枇杷果皮中响应高温胁迫的不同的分子机制。抗氧化酶和蛋白酶体等防御体系,以及无氧呼吸和光呼吸等代谢在高温下的青果期和转色期枇杷果皮中有不同变化模式,在这种响应高温胁迫分子机制的差异,可能是导致三个发育阶段枇杷果皮对高温敏感性不同的一个重要原因。本研究的结果为果实高温日灼的后续研究提供了重要的参考,为枇杷抗高温育种奠定了分子上的基础。