论文部分内容阅读
现在心脑血管栓塞性疾病日益严重地危害着人们的健康，因此研究开发低成本、高效、拥有自主知识产权的新一代预防和治疗心脑血管栓塞性疾病的功能食品和溶栓剂，具有重大的社会和经济效益。
本课题研究了中国传统发酵食品的纤溶特性，并从中国传统豆豉中分离、筛选出六株高产纤溶酶的芽孢杆菌，其中以来源于“八宝豆豉”的DC12-33纤溶活力为最高，该菌株被初步鉴定为B.subtilis。DC12-33在48h进入产酶高峰期，通过正交旋转组合设计拟合DC12-33产纤溶酶与营养因素水平的回归方程，并通过极值分析优化出培养基配方；正交设计试验优化DC12-33产纤溶酶最优条件，在此优化的条件下其产酶量达到780U/ml(尿激酶单位，纤维蛋白平板法测定)。DC12-33发酵液经连续凝胶层析纯化，得到电泳纯的纤溶酶，其最终纯化倍数和回收率分别达到34.6倍和13.0％，纯化酶蛋白比活力达到15494.9U/mg。该酶在还原和非还原条件下SDS-PAGE电泳分析均为单一条带，且酶的酰胺活力完全被丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF和SBTI所抑制，金属离子络合剂EDTA、EGTA以及金属离子对该酶活力几乎没有影响，因此该酶为不含-S-S-的单链丝氨酸蛋白酶，我们命名为“FibrinolyticSubtilisinFS33(豆豉纤溶酶)”。SubtilisinFS33的生化特征和酶动力学研究结果表明，该酶在底物特异性、分子量、N-末端序列等多方面都与已知的微生物源纤溶酶不同，因此是一种新型、潜在的溶栓酶。SubtilisinFS33分子量为30KDa，等电点pI为8.7±0.2，且丝氨酸(含羟基)和色氨酸(含吲哚基团)是其酶活性中心或位于酶活性中心附近。FS33在pH7-12的较宽范围内性质较稳定，但酸性条件酶活力迅速下降；SubtilisinFS33对不同的酰胺键也表现出不同的活力，其最有效的人工合成底物是N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA。该酶的纤溶活力明显高于传统的纤溶酶Urokinase和SubtilisinCarlsberg。
通过体外和动物血栓模型体内试验等，研究评价了SubtilisinFS33对机体凝血系统和纤溶系统的影响及其作用机制。在溶栓机制上，SubtilisinFS33在缺乏内源性溶血因子的情况下，仍能溶解血栓纤维蛋白，表现出直接降解血栓纤维蛋白能力，并且FS33可激活内源性的纤溶酶原，产生活性纤溶酶，因此SubtilisinFS33同时具有直接和间接的溶栓作用。另外，SubtilisinFS33还可降解失活凝血酶和胰激肽释放原酶等其它重要凝血因子。为提高纤溶酶SubtilisinFS33的生物利用度和组织器官归巢趋向性，探讨了血小板膜纤维蛋白原受体配基RGDS肽作为趋血栓靶向剂的可行性，并构建了SubtilisinFS33RGDS-脂质纳米粒载酶系统。硫酸铵梯度法制备的RGDS-载酶脂质体的粒径在50-150nm左右，属于纳米级单室脂质体，其活性包封率30％左右，其导向物RGDS肽的含量约为93ug/ml。SubtilisinFS33经脂质体包被后其温度、极端pH和模拟人工肠液的耐受能力较未经脂质体包被的酶有一定提高，并减缓了体内的释放速度，延长了体内存留时间。不同剂量SubtilisinFS33、RGDS-载酶脂质体给予受试大鼠，其APTT、PT、TT等都明显延长(P＜0.05，P＜0.01)，血浆FDP的含量升高(P＜0.01)，D-dimer呈阳性，而机体ELT值显著降低(P＜0.05)，因此机体抗凝能力明显增高，纤溶能力增强，溶栓效果明显。