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卵巢癌是女性常见肿瘤，位居女性肿瘤发病率第五位和妇科肿瘤致死率第一位。手术和基于铂类药物的联合化疗是其常规治疗手段，但是因其近70%复发和耐药的形成，致使其五年期生存率不高于40%。所以对卵巢癌耐药机制的深入研究尤为必要。研究显示，卵巢癌耐药的产生与抗凋亡的Bcl-1家族成员（如Bcl-2、Mcl-1和Bcl-XL等）高表达紧密相关，这使得抗凋亡和促凋亡相之间的平衡发生倾斜，促使细胞逃逸凋亡而产生耐药。近年来将靶向于Bcl-2家族抗凋亡蛋白的特异性抑制剂应用于肿瘤治疗，相关基础研究不断增加。现已开发了一系列模拟促凋亡成员BH3结构域的小分子抑制剂（如ABT-737/263、Obatoclax和AT-101等）。新型BH3模拟物S1能够同时抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1和Bcl-XL，并具有较高的亲合力。已有报道显示S1能够诱导胶质瘤细胞U251、白血病细胞K562、肝癌细胞SMMC-7721、肺癌细胞SCLC、卵巢癌细胞SKOV3和SKOV3/DDP等多种肿瘤细胞系发生凋亡。本研究室已有研究显示S1在胶质瘤细胞及卵巢癌细胞中，经由线粒体途径介导了凋亡的发生，同时也发生了内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）途径诱导的凋亡，内质网凋亡蛋白Caspase-4信号级联及（c-Jun N-terminalkinase, JNK）途径被激活。ERS触发的未折叠蛋白反应（Unfolded ProteinResponse，UPR）既可能作为适应性途径缓解细胞所面临的应激状态，也可能因严重应激而促使细胞发生凋亡。目前认为，UPR信号途径可以诱导细胞自噬而发挥抵抗凋亡的效应，而Bcl-2家族蛋白与UPR、自噬和凋亡等信号转导途径密切相关。因此，靶向抗凋亡蛋白Bcl-2的BH3模拟物则通过直接或间接影响这些信号转导途径而决定细胞的命运。研究结果显示UPR信号途径的主要通路之一（inositol-requiring kinase1, IRE1）可激活JNK，JNK既能激活凋亡信号，又能介导自噬的活化，还能够调节活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的生成，对细胞命运的决定至关重要。然而，已有研究多采用JNK广谱抑制剂，无法区别与验证JNK亚型的作用，最近发现的新的特异性抑制剂等为研究JNK亚型的功能提供了可能。本研究中，我们采用BH3模拟物S1处理人卵巢癌耐药细胞，以高通量方式对UPR信号通路相关84个基因进行筛选，发现JNK3持续高表达，并通过应用特异性抑制剂Ⅻ和siRNA对JNK3表达在人卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP中的作用及机制进行了探讨。方法（1） MTT法检测BH3模拟物S1处置卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP存活率。（2） S1处置卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP，采用PCR array法检测UPR信号通路84种基因变化，筛选差异表达基因；qPCR确认JNK1、JNK2和JNK3表达基因变化；Western Blot分析JNK3蛋白表达变化。（3）根据JNK3的基因序列（GenBank：NM002753）以及RNAi设计原理，构建三条寡核苷酸序列沉默其表达，命名为Si1，Si2和Si3，并通过荧光标签、RT-PCR、Western blot等技术进行验证，筛选有效沉默序列。（4）利用JNK3特异性抑制剂Ⅻ和siRNA进行干预，光镜下观察细胞形态变化，MTT法检测细胞存活率；TUNEL染色法检测凋亡变化。（5）利用JNK3特异性抑制剂Ⅻ和siRNA进行干预，Western blot分析Bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白的表达；Western blot分析JNK下游信号分子c-Jun、p-c-Jun、p53、Noxa和Bax蛋白表达变化；JC-1染色流式细胞术检测线粒体膜电势的变化；同时，Western blot分析细胞内质网应激相关蛋白Grp78和CHOP的表达。（6） DCFH-DA染色观察人卵巢癌耐药细胞ROS水平；抗氧化剂NAC预处理细胞后合用S1和抑制剂Ⅻ，MTT法检测细胞存活率。（7） AO及Lyso-Tracker Red染色检测胞内酸性结构累积情况；Western blot检测LC3-Ⅱ及p62蛋白的表达；自噬抑制剂氯喹与S1合用检测存活率。结果1. MTT检测显示，S1能够剂量依赖性及时间依赖性降低卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP的存活率。2. PCR array法检测结果显示，在短时间点（3h）UPR信号通路多种未折叠蛋白伴侣分子（包括PERK、ATF6和IRE1三条应答途径）表达上调应答了应激，长时间点（24h）则呈下降趋势，表明ERS趋缓，而JNK3则持续高表达，同时JNK家族其他亚型无明显变化。Western blot检测也显示JNK3蛋白水平表达上调。3.结合mRNA及Western blot检测确认Si3为JNK3有效沉默序列。4.较之S1处理，抑制剂Ⅻ和siRNA干预后，光镜下皱缩细胞增多；细胞存活率显著降低；抑制剂Ⅻ与S1联合应用后细胞凋亡率增加。5.较之S1处理，抑制剂Ⅻ或siRNA与S1合并干预后，Bcl-2表达降低，同时Cleaved Caspase-3蛋白的表达增加；JNK靶标分子c-Jun、p-c-Jun表达明显下降；而c-Jun的负性调节靶标p53表达上调，相应地，p53下游分子Noxa和Bax表达亦明显上调；线粒体膜电位显著下降；未折叠蛋白反应伴侣分子Grp78表达降低、CHOP表达升高。6.抑制剂Ⅻ与S1联合应用后，胞内ROS水平显著增加，氧化损伤导致的存活率降低可被抗氧剂NAC所逆转。7. AO及Lyso-Tranker Red染色结果显示抑制剂Ⅻ与S1联合应用后胞内酸性结构明显增多；同时LC3-Ⅱ表达在S1组、S1合并Ⅻ处理组均显著增加，p62表达在合并处理组显著增加，相应地siRNA干预后也呈现出LC3-Ⅱ和p62表达升高的趋势；氯喹合并S1处理SKOV3/DDP细胞进一步降低了存活率。结论1. BH3模拟物S1能够降低卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP存活率；UPR相关基因JNK3的高表达可能与SKOV3/DDP对BH3模拟物S1的敏感性密切相关。2.抑制JNK3可通过阻断其下游靶蛋白c-Jun的活化，诱导p53表达增加，上调凋亡相关蛋白Noxa和Bax的表达，从而加剧S1诱导卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP凋亡。3.抑制JNK3通过促进细胞氧化损伤从而提高了卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP对BH3模拟物S1的敏感性。4.抑制JNK3通过阻断细胞自噬通量从而提高了卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP对BH3模拟物S1的敏感性。本文首次探讨了JNK家族的亚型JNK3在卵巢癌细胞耐药中的作用，JNK3可能通过减少氧化损伤和激活自噬途径发挥了促进细胞存活的作用。因此JNK3可能是逆转肿瘤细胞耐药的一个潜在靶标。