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邻苯二甲酸二丁酯(DBP)在环境中普遍存在,人体可通过饮水、进食、皮肤接触和呼吸道等途径接触该化学物质。DBP大量存在于人们的消费产品中,是使用量最大、污染最严重的邻苯二甲酸酯(PAEs)之一。大量研究表明,DBP作为环境内分泌干扰物(EDCs)可引起啮齿类动物的生殖毒性。DBP可以影响类固醇激素的合成而损害雄性生殖功能。DBP主要通过代谢为其单体邻苯二甲酸单丁酯(MBP)发挥抗雄激素作用。胆固醇是类固醇激素合成的前体物质,为类固醇激素合成的重要物质基础。胆固醇自胞浆转运至线粒体外膜的过程对类固醇激素的合成起着重要的调节作用。研究表明,中间丝蛋白作为细胞骨架的重要组成成分参与了类固醇激素的合成。波形蛋白(vimentin)是中间丝细胞骨架蛋白的重要成分之一,参与了胆固醇的转运过程。然而,以往对vimentin在DBP/MBP干扰类固醇激素合成中的作用研究甚少。另外,较低剂量DBP/MBP对类固醇激素合成的影响的报道也很少。本研究以小鼠睾丸间质细胞瘤细胞(MLTC-1)和小鼠肾上腺皮质瘤细胞(Y1)为模型探讨低水平MBP暴露对vimentin及类固醇激素合成相关蛋白表达的影响以及miRNA200c对vimentin的调控机制,探讨miRNA200c-vimentin信号通路在低剂量MBP刺激类固醇激素合成中的作用。第一部分miRNA200c-vimentin信号通路在MBP刺激MLTC-1细胞类固醇激素合成中的作用目的观察不同剂量MBP对MLTC-1细胞vimentin和类固醇激素合成的影响,探讨miRNA200c-vimentin信号通路在低剂量MBP刺激MLTC-1细胞类固醇激素合成中的作用。方法1.采用小鼠睾丸间质细胞瘤细胞株(MLTC-1)作为体外培养模型。该细胞的功能与从正常睾丸组织分离的Leydig细胞相似,但合成睾酮量较少,hCG或CT等刺激后,类固醇激素的合成能力增加,主要合成的类固醇激素是孕酮。2. MLTC-1细胞预培养24h或48h, MTT法测定MBP对MLTC-1细胞活力的影响,确定MBP的处理剂量。3. MLTC-1细胞预培养24h,不同浓度MBP处理MLTC-1细胞24h,然后在培养液中加入hCG (0.1U/L)刺激4h,用放射免疫法(RIA)检测细胞培养液上清中的孕酮含量。4. Real-time RT-PCR法测定MLTC-1细胞中miRNA200c和vimentin mRNA表达水平。5.蛋白印迹法(western blot)测定MLTC-1细胞中类固醇激素合成相关因子类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)、P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc)、3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)以及细胞骨架蛋白vimentin和tubulin蛋白表达水平。6.应用RNAi技术下调vimentin的表达水平,再用MBP (10-7M)刺激,观察MLTC-1细胞类固醇激素合成的改变。7.应用RNAi技术抑制或过表达miRNA200c的表达水平,再用MBP(10-7M)刺激,分别观察MLTC-1细胞vimentin表达以及类固醇激素合成的改变。结果1.MBP在10-3 M时对细胞活性产生抑制效应,而在低于10-3 M时对细胞活性未观察到显著性影响。2.MBP处理MLTC-1细胞24h后hCG刺激4h,与对照组相比,孕酮水平在MBP10-7M和10-6M时上升(P<0.05)3. Western blot检测结果表明,不同剂量MBP(10-7-10-4 M)作用于MLTC-1细胞24h后,与对照组相比,vimentin蛋白在MBP 10-7和10-6M时表达量明显增加。StAR蛋白在MBP10-7和10-6M时表达量有所升高。而在其它剂量组,vimentin和StAR蛋白表达没有明显差异。类固醇合成相关蛋白tubulin、β-actin、P450scc和3p-HSD蛋白表达水平在不同剂量MBP作用下没有显著性差异。4.用si-vim处理MLTC-1细胞后,vimentin的表达降低,同时检测到孕酮合成量减少；用si-vim抑制MLTC-1细胞vimentin表达后,再用MBP(10-7M)刺激MLTC-1细胞,vimentin蛋白表达上升,同时孕酮合成量增加(P<0.05)。5.不同剂量MBP (10-7-10-4M)作用于MLTC-1细胞24h后,与对照组相比,miRNA200c在MBP 10-7、10-6和10-5M时表达水平降低(P<0.05)。6.抑制MLTC-1细胞miRNA200c表达后,vimentin蛋白和mRNA表达水平上升,同时孕酮合成升高大约30%(P<0.05)7. MLTC-1细胞miRNA200c过表达后,vimentin蛋白表达下降,同时孕酮合成降低；细胞在MBP 10-7M刺激下,vimentin蛋白表达水平回复,同时孕酮合成上升(P<0.05)。结论1.MBP(10-7和10-6 M)显著增加MLTC-1细胞类固醇激素的合成。2. miRNA200c-vimentin信号通路在低剂量MBP刺激MLTC-1细胞类固醇激素合成中发挥着重要的作用。第二部分miRNA200c-vimentin信号通路在MBP刺激Y1细胞类固醇激素合成中的作用目的观察MBP对Y1细胞vimentin和类固醇激素合成的影响,探讨miRNA200c-vimentin信号通路在低剂量MBP刺激Y1细胞类固醇激素合成中的作用。方法1.采用小鼠肾上腺皮质细胞(Y1)作为体外培养模型。该细胞对ACTH或forskolin反应性与肾上腺皮质细胞相似,合成的类固醇激素主要为孕酮。2.Y1细胞预培养24h和48h, MTT法测定MBP对Y1细胞活力的影响,确定MBP处理剂量。3.Y1细胞预培养24h,不同浓度MBP处理Y1细胞24h,然后在培养液中加入毛喉素(forskolin)刺激12h,收集细胞上清,用放射免疫法(RIA)检测细胞培养液上清中的孕酮含量。4. Real-time RT-PCR法测定Y1细胞中miRNA200c和vimentin mRNA表达水平。5.蛋白印迹法(western blot)测定Y1细胞中类固醇激素合成相关因子类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)、P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc)、3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)以及细胞骨架蛋白vimentin和tubulin蛋白表达水平。6.应用RNAi技术下调vimentin的表达水平,再用MBP (10-7M)刺激Y1细胞,观察Y1细胞类固醇激素合成的改变。7.应用RNAi技术抑制或过表达miRNA200c的表达水平,再用MBP(10-7M)刺激,观察Y1细胞vimentin表达以及类固醇激素合成的改变。结果1.MBP在10-3 M时对细胞活性产生抑制效应,而在低于10-3 M时对细胞活性未观察到显著性影响。2.MBP处理Y1细胞24h后,毛喉素(forskolin)刺激12h,与对照组相比,孕酮水平在MBP 10-7 M时上升(P<0.05)。3. Western blot检测结果表明,不同剂量MBP (10-7-10-4M)作用于Yl细胞24h后,与对照组相比,vimentin蛋白在MBP 10-7和10-6M时表达量明显增加。StAR蛋白在MBP 10-7和10-6 M时表达量有所升高。而在其它剂量组,vimentin蛋白和StAR蛋白表达没有明显差异。类固醇合成相关蛋白tubulin、β-actin、P450scc和3β-HSD蛋白表达水平在不同剂量MBP作用下没有显著性差异。4.用si-vim处理细胞后,vimentin的表达明显降低,同时观察到Y1细胞的孕酮合成量减少；用si-vim抑制Y1细胞vimentin表达后,再用MBP(10-7M)刺激Y1细胞,vimentin蛋白表达上升,同时孕酮合成量增加(P<0.05)。5.不同剂量组MBP(10-7-10-4M)作用于Y1细胞24h后,与对照组相比,miRNA200c在MBP 10-7、10-6和10-5M时表达水平降低(P<0.05)。6.抑制Y1细胞miRNA200c表达后, vimentin蛋白和mRNA表达水平上升,同时孕酮合成升高(P<0.05)。7.Y1细胞miRNA200c过表达后,vimentin蛋白表达下降,孕酮合成降低；miRNA200c过表达后细胞在MBP 10-7M刺激下,vimentin蛋白表达水平回复,同时孕酮合成上升(P<0.05)。结论1.MBP(10-7和10-6M)显著增加Y1细胞类固醇激素的合成。2. miRNA200c-vimentin信号通路在低剂量MBP刺激Y1细胞类固醇激素合成中有着重要的作用。