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富磷环境是指以磷素为主导非生物因子的环境,因其磷素含量远远高于普通环境而视其为一类极端环境。文献显示,富磷环境微生物的研究主要是针对解磷菌所开展的多样性等方面的研究,而全面系统的多样性研究十分有限,尤其是针对具有聚磷活性微生物的多样性等的研究未见系统报道。因滇池周边区域磷素含量高(分布多个磷矿),自然或人为活动所造成的滇池水体磷素含量高,被视为是滇池污染的重要因素之一。因此研究这一特殊环境显得十分必要。
在前期关于云南晋宁山地富磷区植被的调查工作基础上,针对这一极端环境中植物根际细菌多样性及其聚磷活性评价的科学问题,本研究采用变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)、454测序(454 pyrosequencing)和纯培养(Cultivation method)等技术对其进行了研究,初步揭示了这一环境中极高的细菌多样性,对环境因子与细菌类群的相关性进行了讨论,并且筛选得到了一批具有高效聚磷活性的菌株。对于富磷环境中植物根际细菌的多样性研究及解决磷元素对滇池的污染具有一定意义。
本研究根据采样地点环境的不同,将晋宁县上蒜乡段七村旁的富磷山地分为了北部样区和南部样区,经土壤理化因子测定发现,南部样区土壤营养成分整体高于北部样区。
针对于北部样区与南部样区植物根际细菌多样性的比较,DGGE分析结果表明,以细菌16S rRNA基因V3高变区为研究区段,南北样区共27个土样DGGE图谱显示的条带数量高于其它文献报道,达到平均每个样品75.7条,并且各个样品的条带数目及条带分布均有明显不同,反映了样品极高的物种丰富度和多样性。聚类(Clustering)分析表明样品细菌群落构成明显受到了样品来源地以及植物种类的影响,但未能证明二者谁占主导作用。
在454测序实验中,根据DGGE实验得到的结果,选择了地石榴(Ficus tikoua)、茅草(Imperata cylindrica)、紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum)和蔗茅(Saccharumrufipilum)这4种南北样区共有的主要植物的共8个根际土样进行了分析。选取细菌16S rRNA基因V1-V3高变区作为研究区段,测序共得到优化序列106179条,平均每个样品13272条,平均长度427-438.9bp。以97%相似度划分OTU,DS(南部样区地石榴)得到了最多的3979个OTU,ZJP(北部样区紫茎泽兰)最少,得到2867个OTU,每个样品平均得到3472个OTU。在多样性指数分析中,DS在所有相似度水平下均有最高的物种丰富度和多样性,而ZJP样品则最低。8个样品在97%相似度下,平均Shannon指数高达7.23,80%相似度下依然高达4.82,再次显示出样品极高的细菌多样性。稀薄曲线分析表明,除97%相似度下曲线斜率较大之外,其他水平下的曲线都逐渐趋于饱和,证明测序深度基本满足分析要求。在以上三种分析方法中,北部样区总体物种丰富度及多样性均高于南部样区。分类学分析共检测到17个已知门及12个候选门类群。平均相对丰度最高的是变形菌门(Proteobacteria,34.124%),其次是放线菌门(Actinobacteria,21.485%)、酸杆菌门(Acidobacteria,14.236%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,6.584%)、浮霉菌门(Planctomycetes,6.311%)和绿弯菌门(Chloroflexi,5.783%),它们所占比例之和达到了88.523%,未知细菌(包括候选门)所占比例为4.089%。各样品的群落组成类型比较接近,均有15-17个已知门被检测到,差异主要来自于各类群丰度。共253个属被检测到,其中优势属73个,最优势的是Bradyrhizobium属,为重要的固氮菌类群,其次是Gemmatimonas属,其中一个种被广泛报道具有聚磷活性。在细菌类群与土壤理化因子Pearson相关性分析中,受各种理化因子影响最多的类群为Bacteroidetes门,其次是Gemmatimonadetes门和Acidobacteria门。全磷、水解性氮和有效磷是影响类群最多的三个因子,其中有两个是磷元素相关因子。因此可以认为,磷元素确实是本次研究样地的主导非生物因子,它对各样品的细菌群落产生了巨大影响。
在聚磷菌分离筛选与聚磷活性评价实验中,共获得20株高效聚磷菌。这些菌株可以在正磷酸根(PO43+)浓度120mg/L的ISP2液体培养基中良好生长,并能在7天内降低磷浓度80%以上,保持至少28天内不重新升高。经进一步的聚磷活性评价,得到一株在正磷酸根浓度220mg/L条件下仍能保持上述活性的菌株A116,鉴定为Streptomycesyanii,并已申请国家专利,为今后进一步的研究与开发奠定了基础。在对这20株高效聚磷菌进行分子鉴定与系统发育分析后发现,它们全部属于Streptomyces属,并且分属于11个种。属于S.griseoplanus和S.cyaneofuscatus两个种的菌株数量明显多于其他种,且它们在系统发育树中处于同一分支,因此推测该分支上的菌种具有较好的聚磷潜力,可供以后聚磷菌筛选研究参考。