目的：1.通过对子宫腺肌病患者的临床症状进行采集、归纳、整理,以分析和探讨子宫腺肌病的中医证型分布特点,有利于从中医学角度深入研究探讨子宫腺肌病的病因病机及常见症状,以期指导临床,提高疗效,为中医辨证论治及进一步深入研究提供临床依据。2.建立化瘀止痛方指纹图谱,拟定其指纹特征图谱指标成分群,为药效筛选奠定基础。3.原代培养及鉴定子宫腺肌病细胞,为后期中药作用机理研究提供理想实验模型。4.探讨化瘀止痛方及其拆方、主要化学成分对子宫腺肌病细胞凋亡及前列腺素系列(PGF2α、PGE2)、雌激素受体α亚型(ERαmRNA)、缩宫素受体(OTR mRNA)表达水平的影响,明确其具体有效部位,为药物筛选、精简处方奠定基础。方法：1.收集2001年1月-2011年2月广州中医药大学第一附属医院妇科住院及2010年1月-2011年2月妇科门诊的子宫腺肌病患者,通过其一般情况及四诊资料,分析归纳其发病年龄、中医证型分布、常见症状痛经、经期延长、月经过多和不孕的发生率及其相关性。2.采用HPLC法测定化瘀止痛方的指纹图谱,采用SB-C18色谱柱,流动相为甲醇-0.1%磷酸水(梯度洗脱),检测波长为230nm,常规流速1.0 mL/min,柱温为35℃。采用GC-MS法测定化瘀止痛方的特征图谱,气相色谱条件(GC)：采用DB-1石英毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm),载气为氦气,流速1.0mL/min,质谱条件(MS)：EI源(70ev),双灯丝；质量范围m/z 40-400全程扫描,扫描间歇0.5秒。3.采用胶原酶消化法对人子宫腺肌病细胞进行原代培养,并采用免疫细胞化学技术鉴定。4.采用流式细胞术、荧光RT-PCR、酶联免疫法等技术检测化瘀止痛方及其拆方、主要化学成分对子宫腺肌病细胞凋亡率及PGF2a、PGE2、ERαmRNA、OTR mRNA表达的调控,并以米非司酮(RU486)作为对照组。结果：1.本研究共纳入子宫腺肌病病人294例,所有纳入病人中高发年龄段在31-50岁占86.06%,其证型排在第一位的是气滞血瘀型(占44.56%),其次为肾虚血瘀型(占20.75%),第三位是气虚血瘀型(占17.01%)；其痛经发生率为73.5%,月经过多占55.8%,而经期延长发生率为11.9%,合并不孕的病例为10.5%。31岁以上子宫腺肌病患者易出现气滞血瘀证候和热灼血瘀证,而肾虚血瘀证、痰瘀互结证、寒凝血瘀、气虚血瘀证证均多见于41岁以上子宫腺肌病患者。痛经、月经过多多出现在气滞血瘀证中,其次为肾虚血瘀证；而经期延长多见肾虚血瘀证中,其次为气滞血瘀证。2. HPLC指纹图谱：根据10批样品测定结果,共标示出10个共有峰,白芍与化瘀止痛方指纹图谱有2个峰重叠：峰3及峰5,甘草与化瘀止痛方指纹图谱有2个峰重叠：峰7及峰10。经对照品、单味药对照以及参考文献资料,进行了定位归属,鉴定了4个共有峰,其中峰5为芍药苷,峰6为阿魏酸,峰7为甘草苷与延胡索乙素重叠,而芍药苷的相对峰面积最大,其次为甘草苷。3.本次研究采用GC-MS建立了化瘀止痛方挥发油的特征图谱,共计107个特征峰。根据所得到的质谱信息、相对保留时间,经计算机用标准质谱库(NIST和WILEY谱库)检索与标准图谱对照分析鉴定了其中相对含量较大的26个峰,而峰53莪术酮相对含量最高,其次为峰12δ-榄香烯,峰61斯巴醇为第三,峰36为大根香叶烯为第四,峰76藁本内酯为第五。4.成功培养了6例子宫腺肌病细胞并均经免疫细胞化学法鉴定证实,第1代与第8代细胞的生长曲线基本一致。5.对细胞凋亡的影响：与空白对照组相比,RU486组细胞凋亡率明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)；与空白对照组相比,全方组、芍药甘草汤组、余方组、挥发油组细胞的凋亡率均明显上升,差异均具有统计学意义(P<0.05),芍药甘草汤组、余方组、挥发油组差异呈浓度依赖关系(P<0.05),而全方高低浓度组间无明显差异(P>0.05)；与全方高低浓度组相比,挥发油高浓度组的凋亡率升高明显,差异有统计学意义(P<0.05),并且发现全方组对细胞凋亡率的影响明显高于RU486组(P<0.05)。与空白对照组比较,全方、芍药甘草汤及其拆方、各化学成分组子宫腺肌病细胞的凋亡率均显著上升,差异具有统计学意义(P<0.05)；与全方组相比,芍药甘草汤低浓度组、芍药汤高低浓度组、甘草高低浓度组、芍药苷高浓度组、甘草苷高低浓度组子宫腺肌病细胞的凋亡率差异有统计学意义(P<0.05)；与芍药甘草汤低浓度组相比,芍药高低浓度组、芍药苷高低浓度组、甘草苷高低浓度组、芍药苷甘草苷高低浓度组间的凋亡率差异有统计学意义(P<0.05)；与芍药甘草汤高浓度组相比,芍药高低浓度组、甘草低浓度组、芍药苷高浓度组、甘草苷高低浓度组间的凋亡率差异有统计学意义(P<0.05)。6.对PGE2的影响：与空白对照组相比,RU486组细胞上清中PGE2含量差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照组相比,各实验组细胞上清中PGE2含量均有不同程度的下降,全方组、芍药甘草汤组、挥发油组细胞上清中PGE2含量差异有统计学意义(P<0.05),余方组细胞上清中PGE2含量差异无统计学意义(P>0.05)；与全方组相比,芍药甘草汤组、挥发油组细胞上清中PGE2含量差异均无统计学意义(P>0.05)；芍药甘草汤高浓度组、挥发油高浓度组与余方组间相比细胞上清中PGE2含量差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组相比,各实验组细胞上清中PGE2含量均有不同程度的下降,全方高低浓度组、芍药甘草汤高低浓度组、芍药高低浓度组、芍药苷甘草苷高浓度组细胞上清中PGE2含量差异有统计学意义(P<0.05),余各实验组细胞上清中PGE2含量差异均无统计学意义(P>0.05)。与全方高低浓度组相比,甘草苷高低浓度组、RU486组细胞上清中PGE2含量差异有统计学意义(P<0.05),其他各组细胞上清中PGE：含量差异均无统计学意义(P>0.05)。与芍药甘草汤高低浓度组相比,甘草苷高低浓度组细胞上清中PGE2含量较高,差异有统计学意义(P<0.05),余各中药实验组细胞上清中PGE2含量差异均无统计学意义(P>0.05)。7.对前列腺素PGF2a的影响：与空白对照组相比,RU486组细胞上清中PGF2a含量差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照组相比,各实验组子宫腺肌病细胞上清中PGF2a含量均有不同程度的下降,全方高低浓度组、芍药甘草汤高低浓度组、余方高低浓度组、挥发油高低浓度组子宫腺肌病细胞上清中PGF2。含量差异均有统计学意义(P<0.05),并呈浓度依赖关系(P<0.05)；与全方高低浓度组相比,芍药甘草汤高低浓度组、余方高低浓度组、挥发油高低浓度组子宫腺肌病细胞上清中PGF2a含量差异均有统计学意义(P<0.05)；芍药甘草汤高低浓度组、余方高低浓度组、挥发油高低浓度组间两两相比较,芍药甘草汤贡献值最大,挥发油次之,余方最小,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组相比,各实验组子宫腺肌病细胞上清中PGF2。含量均有不同程度的下降,全方高低浓度组、芍药甘草汤高低浓度组及其拆方高低浓度组、主要化学成分高低浓度组子宫腺肌病细胞上清PGF2。含量差异均有统计学意义(P<0.05),并呈浓度依赖关系(P<0.05)；与全方高低浓度组相比,芍药甘草汤高低浓度组及其拆方、主要化学成分组子宫腺肌病细胞上清PGF2a含量差异均有统计学意义(P<0.05),其中芍药甘草汤对子宫腺肌病细胞上清PGF2a含量影响最大(P<0.05),其次为芍药组,第三为芍药苷组。8.对缩宫素受体(OTR mRNA)的影响：与空白对照组相比,RU486组子宫腺肌病细胞OTR mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照组相比,各实验组子宫腺肌病细胞的OTR mRNA表达均有不同程度的下降,全方高低浓度组、余方高浓度组及挥发油高浓度组子宫腺肌病细胞的OTR mRNA表达差异均有统计学意义(P<0.05),芍药甘草汤高低浓度组、余方低浓度组、挥发油低浓度组子宫腺肌病细胞OTRmRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05)；全方高低浓度组与RU486组相比,子宫腺肌病细胞的OTR mRNA表达差异均具有统计学意义(P<0.05)；与全方高低浓度组相比,芍药甘草汤低浓度组子宫腺肌病细胞的OTR mRNA表达差异均有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组相比,各实验组细胞的OTR mRNA表达均有不同程度的下降,全方高低浓度组、芍药苷甘草苷高浓度组子宫腺肌病细胞的OTR mRNA表达差异均有统计学意义(P<0.05),其他各实验组子宫腺肌病细胞的OTR mRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05)；与全方组相比,芍药甘草汤低浓度组、芍药低浓度组子宫腺肌病细胞的OTR mRNA表达差异均有统计学意义(P<0.05),余各组子宫腺肌病细胞的OTRmRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05)；与芍药苷甘草苷高低浓度相比,其他各组中药组子宫腺肌病细胞的OTR mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。9.对雌激素受体α亚型(ERαmRNA)的影响：与空白对照组相比,RU486组子宫腺肌病细胞ERαmRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照组比较,各实验组细胞的ERαmRNA表达均有不同程度的下降,全方高低浓度组、芍药甘草汤高低浓度组子宫腺肌病细胞的ERαmRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)；与RU486组相比,全方高低浓度组、芍药甘草汤高浓度组子宫腺肌病细胞的ERαmRNA表达差异有统计学意义(P<0.05),其他各组与阳性对照RU486组比较,子宫腺肌病细胞的ERαmRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05)；与全方高浓度组相比,余方高浓度组、挥发油高低浓度组子宫腺肌病细胞的ERαmRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组相比,各组细胞的ERαmRNA表达均有不同程度的下降,全方高低浓度组、芍药甘草汤高低浓度组、芍药高低浓度组细胞的ERαmRNA表达差异均有统计学意义(P<0.05),甘草组、芍药苷、甘草苷、芍药苷甘草苷组子宫腺肌病细胞的ERαmRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05)；与全方高浓度组相比,甘草苷低浓度组子宫腺肌病细胞的ERαmRNA表达差异均有统计学意义(P<0.05),其余各组子宫腺肌病细胞的ERαmRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05)；芍药甘草汤高浓度组与甘草低浓度组、甘草苷低浓度组相比,子宫腺肌病细胞ERαmRNA表达差异均有统计学意义(P<0.05),其余各中药实验组与芍药甘草汤高浓度组相比,子宫腺肌病细胞ERαmRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05)。结论：1.子宫腺肌病证型与年龄、主症的具有相关性,气滞血瘀证为子宫腺肌病最常见证型,痛经为子宫腺肌病最常见症状,而痛经亦多见于气滞血瘀证中,因此,气滞血瘀型子宫腺肌病痛经的诊治将是今后研究的重点。2.化瘀止痛方的HPLC指纹图谱结果提示芍药苷、甘草苷为化瘀止痛方的主要化学成分,为化瘀止痛方汤剂后续药理研究的有效部位选择提供了一定参考依据。3.化瘀止痛方的GC-MS特征图谱结果提示化瘀止痛方挥发油中主要化学成分来自没药、三七、广木香、当归、香附、甘草,为化瘀止痛方挥发油的后续药理研究奠定了基础。4.胶原酶消化法培养的子宫腺肌病细胞性能稳定,后续研究主要选择3-6代作为药物干预模型,细胞传代后4-5天加药物干预,选择24h作为药效学作用的检测时间。5.化瘀止痛方能有效治疗子宫腺肌病痛经是其各配伍组分所含化学成分的多靶点综合作用的效果,其可能的作用机理如下：①通过诱导子宫腺肌病细胞的凋亡而使其自然缩小或消退,其中挥发油成分、芍药单味药贡献值较大,芍药苷为芍药的有效成分。②降调子宫腺肌病病灶细胞分泌PGE2、PGF2a,减弱子宫收缩强度,从而缓解痛经的发生。其中芍药甘草汤、挥发油可能是化瘀止痛方降调子宫腺肌病细胞上清中PGE2含量的有效组分,而芍药及芍药苷甘草苷组可能为芍药甘草汤降调子宫腺肌病细胞上清中PGE2含量的有效组分。在化瘀止痛方对子宫腺肌病细胞PGF2a分泌影响方面,化瘀止痛方全方优于拆方及主要化学成分组药物,其中芍药甘草汤贡献值最大,挥发油次之,而芍药甘草汤起作用可能与芍药及其主要化学成分芍药苷有关。③降低子宫腺肌病病灶细胞OTR mRNA表达,直接降低了OT与OTR的结合率,减缓了子宫平滑肌的收缩强度,有效缓解了患者的痛经症状,其中余方组、挥发油组、芍药苷甘草苷贡献值较大。④降低子宫腺肌病病灶细胞ERαmRNA表达,而雌激素的生物学效应大小与靶细胞内ER高低有关,当ERαmRNA表达降低时,E2与ER结合率降低,E2生物学效应降低,减少或阻断了异位病灶在肌层中的发生发展,雌激素对子宫蠕动的调节作用减缓,子宫收缩性减弱,痛经症状减轻或消失,芍药的贡献较大。