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由于乳酸菌的益生作用,乳酸菌分子生物学及作用机制成为近年来学术界的研究热点。乳酸菌中的乳杆菌属自身的免疫原性和优良的胃肠道定植能力使得其作为食品级基因工程受体菌的应用前景十分广阔。鉴于乳杆菌属中的植物乳杆菌(LactobacilIus plantarum)在食晶、饲料和医疗行业的巨大商业价值,本研究旨在从食品原料中分离鉴定获得植物乳杆菌,并从中筛选到一株有望成为食品级基因工程受体菌的菌株,同时鉴定该受体菌的抗突变活性,以期筛选出一株自身具有抗突变活性并且能够成为食品级基因工程受体菌的优良菌株。
本研究从韩国泡菜中分离纯化出五株菌Lact1、Lact2、Lact3、Lact4和Lact5,经形态学、生化、生理鉴定和16S rDNA全序列分析鉴定,将测序结果在GenBank上进行Blast比对,构建系统发育树,鉴定出五株菌均与植物乳杆菌的亲缘关系最近。选择没有天然质粒存在且是nisin敏感的菌株作为食品级基因工程受体菌的候选菌株,使用带有nisI基因作为nisin免疫选择标记的食品级克隆载体pLEB590对其进行转化,优化电转化条件,得出使用含有终浓度为6%甘氨酸的MRS制备感受态细胞,2kV电压下,最高可得到8.204x10<3>转化子/μg质粒DNA。携带载体pLEB590的菌株可以耐受最大为550 IU/ml的nisin浓度,并且在nisin选择压力下能够保持外源质粒的遗传稳定性。利用SOS显色反应鉴定出Lact2对基因毒素4-NQO具有抗突变活性,且抗突变率约64%。
本课题初步筛选到一株自身具有抗突变活性并且有潜力成为基因工程受体菌的植物乳杆菌,为利用nisin免疫作为筛选标记的食品级表达体系的构建奠定了基础。