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已有研究表明非编码RNA可参与多种生理病理过程,其在疾病的发生发展中发挥重要作用。黄韧带骨化症及骨质疏松症是常见的慢性骨科疾病,如不能得到及时的诊断和治疗,将严重影响患者的生存质量。目前,鲜有报道非编码RNA在黄韧带骨化症或骨质疏松症中的功能及机制。本研究旨在通过基因芯片或测序筛选出骨化黄韧带组织（Ossification of ligamentum flavum,OLF）中显著差异表达的m RNA、lnc RNA、mi RNA及circ RNA,并对差异RNA进行关联分析及功能探究;同时明确mi R-342-3p在成骨分化中的功能及机制,为黄韧带骨化和骨质疏松症的诊断和治疗提供新思路。方法:1.标本采集:收集术中取出的新鲜骨化的黄韧带组织和正常黄韧带组织。用液氮研磨法快速提取组织样本RNA,并通过RNA电泳和2100质量检测法进行检测。从中分别选4个合格的正常黄韧带组织和4个合格的骨化黄韧带组织的RNA进一步实验。2.筛选OLF中差异表达的m RNA:通过基因芯片分析,OLF与正常黄韧带组织（ligamentum flavum,LF）相比,筛选出差异倍数>2,p<0.05的差异m RNAs。随机挑选10个m RNAs在扩大样本中进行q PCR检测表达差异,确证芯片结果可信。进一步做差异m RNAs的GO和KEGG分析,确证这些差异m RNAs是否参与成骨分化。3.筛选OLF中差异表达的lnc RNA:通过基因芯片分析,OLF与LF相比,筛选出差异倍数>2,p<0.05的差异lnc RNAs。随机挑选10个lnc RNAs在扩大样本中进行q PCR检测表达差异,确证芯片结果可信。选择两个上调的lnc RNAs,在h MSCs向成骨分化过程中,分别敲低lnc RNA后,通过q PCR检测促成骨分化相关基因表达量的改变,并进行ALP染色,确证差异lnc RNAs在细胞成骨分化中的作用。在m RNAs芯片结果中挑选10个已知的与骨化或成骨分化相关的差异m RNAs,联合m RNAs和lnc RNAs芯片结果,筛选出与上述m RNAs共表达的差异lnc RNAs,构建共表达（conding-non-coding,CNC）网。4.筛选OLF中差异表达的mi RNA:通过基因测序技术,OLF与LF相比,筛选出差异倍数>2,p<0.05的差异mi RNAs。随机挑选10个mi RNAs在扩大样本中进行q PCR检测表达差异,确证芯片结果可信。选定一个下调的mi RNA,在h MSCs向成骨分化过程中过表达,通过q PCR检测促成骨分化相关基因的表达变化,同时进行ALP染色,确证差异mi RNA在细胞成骨分化中的作用。通过Target Scan,mi RBase和mi Randa数据库,预测差异mi RNAs的靶基因;同时与m RNAs芯片结果中差异m RNAs取交集,进一步再筛选出与mi RNAs负性差异表达关联的m RNAs。进行上述筛选出的m RNAs的GO和KEGG分析,确证其是否与骨化相关。5.筛选OLF中差异表达的circ RNA:通过基因芯片技术,OLF与LF相比,筛选出差异倍数>2,p<0.05的差异circ RNAs。随机挑选10个circ RNAs在扩大样本中进行q PCR检测表达差异,确证芯片结果可信。选择一个上调的circ RNA进行功能验证。在h MSCs向成骨分化过程中,敲低选定的circ RNA后,通过q PCR检测ALP、Col1α1、Bglap及RUNX2的表达量变化,并进行ALP染色,确证差异circ RNA在细胞成骨分化中的作用。软件预测验证的lnc RNAs、circ RNA及mi RNA是否存在关联,以此进一步构建ce RNA调节网。6.确定成骨分化过程中mi R-342-3p的表达水平:在OLF和正常黄韧带样本中,健康体检者、OLF及骨质疏松患者的血标本中,骨质疏松模型小鼠股骨组织中及细胞成骨分化诱导过程中,通过q PCR检测ALP、OCN及mi R-342-3p的水平。7.确定mi R-342-3p在细胞成骨分化中的功能:分别用mi R-342-3p抑制剂（antagomir-342-3p）或mi R-342-3p激动剂（agomir-342-3p）转染原代人骨髓间充质干细胞h MSCs,q PCR确保mi R-342-3p的干扰和过表达效果,进一步成骨诱导培养3天或6天后,提取RNA和蛋白质,通过q PCR和Western Blot检测促成骨分化相关基因的表达;诱导6天时,通过ALP染色和活性检测测定ALP的沉积和活性,茜素红染色检测钙结节的形成。同时检测mi R-342-3p在小鼠前成骨细胞MC3T3-E1向成骨细胞分化过程中的作用。8.确定mi R-342-3p的作用机制:通过mi RWalk和mi Rnada数据库,预测mi R-342-3p的靶基因,取两个数据库的交集基因,通过萤光素酶报告基因实验验证mi R-342-3p的靶基因。通过q PCR和Western Blot,在h MSCs中敲低或过表达mi R-342-3p后,检测靶基因的表达变化。分别敲低或过表达靶基因,检测细胞成骨分化能力的改变。再通过Ch IP实验,确证mi R-342-3p的靶基因对促成骨分化相关基因的作用机制。9.确定mi R-342-3p差异表达的机制:人前成骨细胞系h FOB1.19和h MSCs向成骨方向诱导分化后,q PCR检测mi R-342-3p的母基因EVL的表达量变化,与mi R-342-3p的差异变化是否有关联。通过MSP检测h FOB1.19和h MSCs向成骨细胞分化前后EVL/mi R-342的启动子区域DNA的甲基化状态,确证成骨分化后mi R-342-3p高表达的机制。结果:1.通过基因芯片技术,我们筛选出共2054个m RNAs、2567个lnc RNAs和627个circ RNAs的表达存在差异,通过基因测序筛选出共28个mi RNAs的表达存在差异。2.根据不同RNA之间的差异倍数及关联分析,构建出lnc RNA-m RNA共表达网,mi RNA-mRNA靶基因预测网及circRNA-mi RNA-mRNA机制网。3.在h MSCs向成骨细胞分化过程中,分别敲低lnc RNA ENST00000608133、ENST00000599584、circ0050139或过表达mi R-19b-3p后,促成骨分化相关基因明显下调。并且软件预测出lnc RNA ENST00000608133、ENST00000599584、circ0050139和RUNX2均是mi R-19b-3p的靶基因,因此构建出ce RNA机制网。4.mi R-342-3p在黄韧带骨化组织中、OLF患者血标本中、细胞成骨分化后表达水平升高,在骨质疏松患者血标本、骨质疏松模型小鼠股骨组织中表达量降低。5.mi R-342-3p促进h MSCs、MC3T3-E1向成骨细胞分化。6.mi R-342-3p靶向ATF3的3’UTR区,抑制ATF3的表达。7.ATF3抑制h MSCs向成骨细胞分化。8.ATF3可直接结合促成骨分化相关基因的启动子区域以抑制其靶基因的表达,mi R-342-3p通过释放ATF3对靶基因的抑制以促进h MSCs向成骨细胞分化。9.h MSCs和人前成骨细胞h FOB1.19向成骨方向诱导分化后,EVL/mi R-342的启动子区域Cp G岛发生去甲基化从而导致mi R-342-3p高表达。结论:本研究利用基因芯片及测序技术筛选骨化黄韧带组织中差异表达的m RNAs,lnc RNAs,circ RNAs及mi RNAs,根据不同RNA之间的差异倍数及关联分析,构建lnc RNA-m RNA共表达网,mi RNA-m RNA靶基因预测网及circ RNA-mi RNA-m RNA机制网,同时通过敲低及过表达实验确证了以mi R-19b-3p为基础的mi RNA-circ RNA-lnc RNA-m RNA分子网络机制。进一步研究发现mi R-342-3p在骨化黄韧带组织中、黄韧带骨化患者的血标本中高表达,在骨质疏松患者血中及骨质疏松小鼠股骨组织中低表达;在人及小鼠的前成骨细胞向成骨细胞分化后表达量显著增多。在人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中,敲低mi R-342-3p损伤成骨活性及基质矿化,而过表达mi R-342-3p促进成骨细胞分化。机制上,通过软件预测及实验验证发现,mi R-342-3p通过靶向ATF3发挥促成骨分化作用;并且发现在成骨分化过程中,mi R-342-3p的母基因EVL启动子区域发生去甲基化,从而导致成骨分化过程中mi R-342-3p的高表达。综上,本研究系统分析了黄韧带骨化过程中差异表达的非编码RNAs,深入探讨了mi R-342-3p在成骨分化中的功能和机制,为黄韧带骨化症和骨质疏松症的诊断和治疗提供理论依据。