目的：乌头类中药临床应用广泛,具有抗炎,免疫抑制,强心,止痛,抗肿瘤和降血压等功效,临床上常用来治疗风湿性关节炎,跌打损伤,高血压和肿瘤等各种疾病。但因具有强烈毒性,乌头类中药的临床应用也受到限制。乌头类生物碱是乌头类中药的主要活性成分,同时也是其毒性成分。外排转运蛋白(efflux transporters, ETs),主要包括P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp),乳腺癌耐药蛋白(Breast Cancer Resistance Protein, BCRP)和多药耐药蛋白2(Mutidrug Resistance Protein 2, MRP2),可将药物或其它化学物质排出细胞外,使机体免受或减少外来物的侵扰。研究报道核受体(Nuclear receptors, NRs)和核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor, Nrf2)信号通路是人体ETs表达的重要调控因子。我们前期研究表明,ETs可外排乌头类生物碱。然而,乌头类生物碱对ETs的影响尚未知晓,其表达和活性是否和乌头类生物碱的毒性相关也未见报道。因此,本研究根据毒性高低选取了三种典型的乌头类生物碱：乌头碱(aconitine, AC),苯甲酰乌头原碱(benzoyiaconine, BAC)和乌头原碱(aconine),考察其对P-gp,MRP2和BCRP的调控及其机制。通过本研究结果,可了解服用乌头类中药后,体内外排转运蛋白的变化规律,预测乌头类中药与外排转运蛋白底物药物联合使用时,发生药物相互作用的可能性,为临床上乌头类中药联合用药的安全性提供理论指导。方法：采用人源LS174T和Caco-2结肠癌细胞模型,人源HepG2肝癌细胞模型,稳定表达启动子抗氧化应答元件(antioxidant response element, ARE)-荧光素酶的HepG2-C8细胞模型和FVB小鼠模型。分别采用Western-blot和real-time PCR考察AC/BAC/aconine对P-gp/MRP2/BCRP,以及信号通路蛋白孕烷X受体(pregnane X receptor, PXR),组成型雄甾烷受体(constitutive androstane receptor, CAR)和Nrf2表达水平的影响；采用共聚焦显微镜观察P-gp/MRP2/BCRP在细胞膜上的定位和表达；采用荧光探针底物结合流式细胞仪考察AC/BAC/aconine对P-gp/MRP2/BCRP外排功能的影响；采用稳定转染细胞系,考察AC/BAC/aconine对ARE-荧光素酶报告基因的影响等。结果：1乌头类生物碱调控P-gp的作用及机制1.1 AC,BAC和aconine对LS174T和Caco-2细胞活性无显著影响。1.2在LS174T和Caco-2细胞中,乌头类生物碱显著上调P-gp的蛋白和基因表达,且AC的上调作用强于BAC和aconine。AC也显著上调FVB小鼠体内空肠、回肠和结肠段的P-gp蛋白表达。1.3在细胞中,乌头类生物碱尤其是AC显著增强细胞膜上P-gp的荧光强度,表明乌.头类生物碱可促进P-gp蛋白转移并富集于细胞膜上。1.4在细胞中,核受体抑制剂酮康唑显著逆转乌头类生物碱对P-gp的诱导作用；同时,PXR和CAR也被乌头类生物碱显著上调,且表达趋势和P-gp一致,Pearson相关分析显示PXR和CAR蛋白表达与P-gp基因表达显著相关。结果表明,核受体介导乌头类生物碱对P-gp的诱导作用,PXR和CAR受体是最有可能参与其过程的两个核受体。1.5在细胞中,乌头类生物碱显著减弱细胞内罗丹明123(rhodamine 123, Rh123)的荧光强度,P-gp活性抑制剂维拉帕米可以显著增加细胞内的Rh123平均荧光强度。结果表明,P-gp介导细胞内Rh123的外排；乌头类生物碱可显著增强P-gp的外排功能,且AC的作用强度大于BAC和aconine。1.6在细胞中,乌头类生物碱显著增加细胞内ATP水平,且AC的增加强度大于BAC和aconine,趋势和P-gp功能变化趋势一致；同时,乌头类生物碱显著增强细胞内线粒体质量,增加趋势和ATP水平变化趋势一致。表明乌头类生物碱可通过增强线粒体质量上调细胞内ATP水平,从而增强P-gp的外排功能。1.7乌头类生物碱尤其是AC预先培养LS174T和Caco-2细胞后,可显著减弱P-gp底物抗癌药物(长春新碱和阿霉素)对细胞的毒性作用。1.8小剂量AC预先给药FVB小鼠后,可降低FVB小鼠对单次大剂量AC给药的急性毒性反应,且24 h后小鼠死亡率显著降低。2乌头类生物碱调控MRP2和BCRP的作用及机制2.1 AC,BAC和aconine对HepG2细胞活性无显著影响。2.2在LS174T,Caco-2和HepG2细胞中,乌头类生物碱显著上调MRP2和BCRP的蛋白和基因表达,且AC上调作用弱于BAC和aconine;AC,BAC和aconine显著上调FVB小鼠空肠、回肠和结肠段中MRP2和BCRP的蛋白表达,且AC的上调作用弱于BAC和aconine。2.3在细胞中,乌头类生物碱尤其是aconine可显著增强细胞膜上MRP2和BCRP的荧光强度,表明乌头类生物碱可促进MRP2和BCRP蛋白转移并富集于细胞膜上。3.3乌头类生物碱可显著上调细胞总蛋白和核蛋白中Nrf2的蛋白表达,且上调程度AC<BAC<aconine,表明乌头类生物碱可促进Nrf2蛋白由细胞质中转移入细胞核中,且aconine的作用最强。同时,在HepG2-C8细胞中,乌头类生物碱可浓度和时间依赖性激活ARE荧光素酶活性,且上调程度AC<BAC<aconine,表明乌头类生物碱可增强Nrf2与ARE结合而激活Nrf2通路,从而上调MRP2和BCRP的表达。3.4在Caco-2,LS174T和HepG2细胞中,乌头类生物碱可显著减弱胞内CDF平均荧光强度,MRP2活性抑制剂MK571可以显著增加细胞内的CDF平均荧光强度,证实MRP2介导CDF的排外。结果表明乌头类生物碱可显著增强MRP2的外排功能。3.5 在 Caco-2和LS174T细胞中,乌头类生物碱未显著改变胞内Hoechst 33342平均荧光强度,但在HepG2细胞中,乌头类生物碱显著降低胞内Hoechst 33342平均荧光强度,且BCRP活性抑制剂K0143可以显著增加胞内Hoechst 33342平均荧光强度,证实BCRP介导Hoechst 33342的排外。结果表明乌头类生物碱可显著增强HepG2细胞中BCRP的外排功能,对Caco-2和LS174T细胞中BCRP的外排功能无显著影响。结论：乌头类生物碱可显著上调P-gp的表达和外排功能,且上调程度呈现AC>BAC>aconine的趋势；核受体,特别是PXR和CAR受体可能介导乌头类生物碱对P-gp的诱导作用；乌头类生物碱可上调MRP2和BCRP的表达和外排功能,且上调程度呈现AC<BAC<aconine的趋势,Nrf2-ARE信号通路可能介导乌头类生物碱对MRP2和BCRP的诱导作用。由于临床上,乌头类中药常与其他药物联合使用以治疗复杂性疾病,我们推测,当乌头类中药与P-gp、MRP2和/或BCRP底物药物联合使用时,很可能发生由这些ETs介导的药物相互作用。因此,临床上当乌头类中药联合用药时,需密切关注,以防药物相互作用等不良反应的发生。