沙门菌是重要的人兽共患病原菌之一,严重威胁人和动物的健康。肠炎沙门菌是最主要的沙门菌血清型之一。针对沙门菌感染的防控已成为人兽共患病原菌人病兽防的迫切需要。沙门菌具有在宿主巨噬细胞内生存的免疫逃逸能力,呈持续性感染。沙门菌能够诱导巨噬细胞极化,控制巨噬细胞内细菌载量,是其致病性的主要原因之一。但有关免疫逃逸方面的致病机制的研究相对较少,严重制约有效疫苗和药物的研发,妨碍畜禽养殖阶段的沙门菌病防控。巨噬细胞极化是指巨噬细胞功能表型的变化,通常包括典型激活（M1）和替代激活（M2）两种表型。巨噬细胞M1型极化可促进炎性反应和Th1型免疫反应。M2型极化可抑制炎性反应,促进Th2型免疫反应。巨噬细胞M2型极化在促进病原体免疫逃逸和持续感染中发挥重要作用。沙门菌能够诱导巨噬细胞M1型极化,清除细菌,也能够通过基因异质性表达调控巨噬细胞M2型极化,促进沙门菌在巨噬细胞内定殖,导致在体内呈持续性感染。前期研究发现,与野生株相比,肠炎沙门菌spiC基因缺失株,在巨噬细胞内有更强的增殖能力且可持续存在,诱导细胞分泌IL-10水平显著升高。该现象提示肠炎沙门菌spiC缺失株感染的巨噬细胞偏向于M2型极化,但是尚无具体研究报道SpiC蛋白在调控沙门菌诱导巨噬细胞极化过程中的作用。因此,本研究从体内外试验研究具体阐述肠炎沙门菌SpiC蛋白调节巨噬细胞极化分型及其分子机制。1、肠炎沙门菌spiC基因缺失株诱导巨噬细胞M2型极化构建肠炎沙门菌spiC基因的缺失株（SEΔspiC）及回补株（SEΔspiC::spiC）,证明spiC基因的缺失和回补不影响肠炎沙门菌的正常生长和生化特性,但SEΔspiC和Z11ΔspiC在RAW264.7和BMDM巨噬细胞内表现出明显更强的增殖能力。qPCR检测显示,与野生株相比,SEΔspiC感染RAW264.7细胞后,M1指标 CXCL9、TNF-α、iNOS 和 CD86 的 mRNA 水平降低,M2 指标 IL-10、TGF-β、Arg-1和CD206的mRNA水平升高;同样,ELISA检测显示SEΔspiC感染RAW264.7细胞后,细胞培养上清中促炎因子IL-1β和IFN-γ的水平降低,抑炎因子IL-10水平升高;FACS检测显示SEΔspiC感染RAW264.7细胞后,细胞培养上清中促炎因子TNF-α、胞内NO、ROS和细胞表面分子CD86表达水平降低,抑炎因子IL-10和细胞表面分子CD206表达水平升高;Western blot结果表明SEΔspiC感染RAW264.7细胞后,胞内iNOS蛋白表达水平降低,Arg-1蛋白表达水平上升;SEΔspiC感染RAW264.7后,细胞培养上清中LDH水平下降,而细胞内Arginase活性上升。spiC启动子缺失株在巨噬细胞内增殖能力增强,细胞培养上清中IL-10表达水平提高,与SEΔspiC对巨噬细胞的效应一致。利用基因组融合表达株SEspiC::gfp研究显示,SpiC蛋白均能在三种培养基LPM1、LPM2和LPM3中被诱导表达,其中在LPM2中表达水平最高。根据LPM2诱导模型,通过激光共聚焦显微技术、qPCR和Western blot分析表明SpiC蛋白表达受NO抑制,并呈浓度依赖性;同时,SE在巨噬细胞内的增殖能力增强,IL-10表达提高,该结果与SEΔspiC诱导巨噬细胞M2型极化效应一致。2、SEΔspiC促进PKM2-JAK2-STAT3-IL10诱导巨噬细胞M2型极化沙门菌感染RAW264.7细胞后,与野生株相比,SEΔspiC诱导细胞培养上清中IL-10的ELISA水平显著提高,激光共聚焦观察显示胞内p-STAT3核转移能力增强,Western blot结果表明胞内STAT3和JAK2的磷酸化水平以及PKM2表达水平提高。分别利用STAT3、JAK2和PKM2抑制剂处理巨噬细胞后,与未处理组相比,SEΔspiC在巨噬细胞内的增殖能力都显著降低,细胞培养上清中的IL-10水平显著下降,并呈浓度依赖性。Western blot显示,JAK2抑制剂处理后,SEΔspiC感染的巨噬细胞内STAT3的磷酸化水平降低,呈浓度依赖性,表明STAT3为JAK2的下游底物。PKM2抑制剂处理后,SEΔspiC感染的巨噬细胞内JAK2和STAT3的磷酸化水平下降,呈浓度依赖性,表明JAK2和STAT3均处于PKM2的下游。这些结果表明PKM2正调控SEΔspiC诱导巨噬细胞M2型极化。3、SEΔspiC诱导动物体内巨噬细胞M2型极化SEΔspiC和SE分别感染C57BL/6小鼠,肝脏和脾脏内的载菌量分析表明,SE组的脏器载菌量显著高于SEΔspiC组。与SE相比,SEΔspiC感染小鼠后,血清中的IL-10水平显著提高;qPCR检测显示,小鼠脾脏组织M1指标TNF-α、ROS 和 CD86 的 mRNA 水平下降,M2 指标 IL-10、Arg-1 和 CD206 的 mRNA 水平上升;FACS分析显示,随着感染时间的延长,SEΔspiC和SE组感染的小鼠脾脏巨噬细胞中总体均呈M1型巨噬细胞（CD86+）占比逐渐下降和M2型巨噬细胞（CD206+）占比轻微上升,但是两组间数量存在差异。与SE组相比,SEΔspiC感染小鼠脾脏巨噬细胞中M1型巨噬细胞（CD86+）数量更少,而SEΔspiC组M2型巨噬细胞（CD206+）数量持续缓慢上升,结果表明SEΔspiC感染能够偏向诱导巨噬细胞M2型极化。4、SpiC蛋白通过NF-κB通路和互作PKM2诱导巨噬细胞M1型极化激光共聚焦和Western blot分析表明SpiC能够在细胞内表达。应用TEM-1报告系统证明SpiC蛋白可分泌到肠炎沙门菌感染的宿主细胞的胞浆中,表明SpiC蛋白是Ⅲ型分泌系统的效应蛋白。NF-κB通路是M1型极化经典通路,在HeLa细胞和RAW264.7细胞感染模型中,经双荧光素酶报告系统、Western blot和激光共聚焦分析,结果表明SpiC介导肠炎沙门菌促进HeLa细胞和RAW264.7细胞内荧光素酶活性、胞内IκBα的降解和p65的核转移,显示SpiC能够介导沙门菌促进HeLa细胞和RAW264.7细胞内的NF-κB通路的活化。真核质粒表达SpiC蛋白也促进HeLa细胞和RAW264.7细胞内荧光素酶活性、胞内IκBα的降解和p65的核转移,显示SpiC可能直接参与了巨噬细胞M1型极化;而SEΔspiC诱导巨噬细胞M2型极化受PKM2的正调控,推测SpiC可能与PKM2互作,介导巨噬细胞M1型极化。Pull-down和激光共聚焦试验结果证明SpiC和PKM2在胞内外的确存在相互作用,并在胞浆中存在共定位。总之,肠炎沙门菌SpiC蛋白通过激活NF-κB通路和互作PKM2,诱导SE感染的巨噬细胞M1极化。当spiC基因缺失或表达被NO抑制时,SE通过促进PKM2-JAK2-STAT3-IL10轴诱导巨噬细胞M2型极化。该机制的发现,拓宽了沙门菌感染与免疫的理论机制,也为沙门菌疫苗和新型药物研制及畜禽沙门菌病的防控奠定理论基础。