第一部分PDGF-BB对血管平滑肌细胞TGF-β₁及TGF-β信号系统Smad依赖性途径的下游蛋白的影响目的建立成年雄性大鼠主动脉血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的体外培养方法；检测成年雄性大鼠VSMCs内血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）-BB mRNA的表达；探讨PDGF-BB对VSMCs内转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β₁生成和分泌的影响；并探讨PDGF-BB及其诱导过表达的TGF-β₁对TGF-β信号系统Smad依赖性途径的下游蛋白，主要包括TGF-βⅠ类受体（ALK-5）、Smurf2、pSmad2／3、Smad4、Smad7的影响。方法1．从成年雄性大鼠（体重100～120g，周龄8～9周）取出主动脉，用胶原酶Ⅰ消化法建立大鼠主动脉VSMCs的体外培养技术。2．用RT-PCR方法检测VSMCs内PDGF-BB mRNA的表达。2．用RT-PCR的方法检测PDGF-BB在剂量曲线和时间曲线上刺激VSMCs表达TGF-β₁ mRNA的水平。3．用ELISA的方法检测PDGF-BB在剂量曲线和时间曲线上影响VSMCs分泌TGF-β₁蛋白分子的水平。4．用Western Blot方法检测TGF-β信号系统下游蛋白，包括TGF-βⅠ类受体（ALK-5）、Smurf2、pSmad2／3、Smad4、Smad7的蛋白水平。结果1．胶原酶Ⅰ消化法种植VSMCs，到第七天细胞基本融合，呈典型的“谷峰”样。细胞经胰蛋白酶消化传代至5～6代（用作试验细胞）时，免疫荧光检测细胞内α-SMA表达丰富。2．在正常成年雄性大鼠的VSMCs内检测不到PDGF-BB mRNA的表达。3．在无血清的培养条件下，PDGF-BB（0，0.6，2.5，10，40ng／ml）刺激VSMCs 12小时，TGF-β₁ mRNA表达呈剂量依赖性增加。4．在无血清的培养条件下，PDGF-BB（10ng／ml）刺激VSMCs 0，3，6，12，24，48小时，TGF-β₁ mRNA表达呈时间依赖性增加。5．在无血清的培养条件下，PDGF-BB（0，0.6，2.5，10，40ng／ml）刺激VSMCs 24小时，TGF-β₁分子蛋白分泌水平呈剂量依赖性增加。6．在无血清的培养条件下，PDGF-BB（10ng／ml）刺激VSMCs 0，3，6，12，24，48小时，TGF-β₁分子蛋白分泌水平呈时间依赖性增加。7．在无血清的培养条件下，PDGF-BB（0，0.6，2.5，10，40ng／ml）刺激VSMCs 48小时，ALK-5表达呈剂量依赖性增加。8．在无血清的培养条件下，PDGF-BB（0，0.6，2.5，10，40ng／ml）刺激VSMCs 48小时，Smurf2表达呈剂量依赖性增加。9．在无血清的培养条件下，PDGF-BB（0，0.6，2.5，10，40ng／ml）刺激VSMCs 48小时，pSmad2／3表达呈剂量依赖性增加。10．在无血清的培养条件下，PDGF-BB（0，0.6，2.5，10，40ng／ml）刺激VSMCs 48小时，Smad4表达呈剂量依赖性增加。11．在无血清的培养条件下，PDGF-BB（0，0.6，2.5，10，40ng／ml）刺激VSMCs 48小时，可呈剂量依赖性抑制Smad7的表达。12．在无血清的培养条件下，PDGF-BB调节的TGF-β信号系统下游蛋白的表达，在加入中和性抗TGF-β₁抗体后，这些蛋白的表达可见部分回调，并有明显的意义。结论1．胶原酶Ⅰ消化细胞种植法是一种稳定、可靠的培养成年雄性大鼠VSMCs的试验方法，培养出的VSMCs可用作体外细胞试验。2．正常成年雄性大鼠VSMCs内并不表达PDGF-BB mRNA。3．PDGF-BB在无血清的培养条件下，可有效地刺激VSMCs内TGF-β₁ mRNA的合成和TGF-β₁蛋白分子的分泌。4．PDGF-BB在无血清的培养条件下，可上调VSMCs内TGF-βⅠ类受体（ALK-5）的表达，表明在PDGF-BB刺激下，VSMCs膜上TGF-βⅠ类受体被激活。5．PDGF-BB在无血清的培养条件下，可上调VSMCs内pSmad2／3的表达，表明在PDGF-BB刺激下，VSMCs内TGF-β信号系统中Smad依赖性途径被起动。6．PDGF-BB在无血清的培养条件下，可上调VSMCs内Smad4的表达。表明PDGF-BB对Co-Smad（common regulatory Smad）蛋白也有上调作用，这有利于pSmad2／3与Smad4形成复合体。7．PDGF-BB在无血清的培养条件下，可下调VSMCs内Smad7的表达，这有利于信号在ALK-5至pSmad2／3及Smad4之间传导。8．PDGF-BB上调VSMCs内Smurf2的表达，这表明PDGF-BB可起动TGF-β信号系统中的负反馈调节。9．中和性抗TGF-β₁抗体可部分回调TGF-β信号系统中Smad依赖性途径下游蛋白的表达。这表明TGF-β信号系统Smad依赖性途径下游蛋白的表达的增加或减少至少部分是由PDGF-BB刺激细胞内过表达TGF-β₁所引起的。第二部分PDGF-BB及由其诱导过表达的TGF-β₁对血管平滑肌细胞增生和增值细胞核抗原表达的影响目的探讨PDGF-BB对VSMCs增生和细胞内增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的影响。探讨由PDGF-BB诱导的过表达TGF-β₁对VSMCs增生和细胞内PCNA的影响。方法1．用Counting Cell Kit（CCK）-8方法检测PDGF-BB和TGF-β₁对VSMCs增生的剂量曲线。2．用Western Blot方法检测PDGF-BB对VSMCs增生内增殖细胞核抗原（PCNA）的剂量曲线。3．用中和性抗TGF-β₁抗体阻断过表达自分泌TGF-β₁的作用，用Counting Cell Kit-8方法检测PDGF-BB对VSMCs增生生物学效应的变化。4．用中和性抗TGF-β₁抗体阻断过表达的TGF-β₁的作用，用Western Blot方法检测PDGF-BB对VSMCs增生内PCNA表达生物学效应的变化。结果1．PDGF-BB作用于VSMCs 48小时，VSMCs的增生和细胞内PCNA的表达呈剂量依赖性增加。2．TGF-β₁对VSMCs作用48小时，VSMCs增生也呈剂量依赖性，但低剂量TGF-β₁（0.02ng／ml；0.1ng／ml）对VSMCs起抑制作用，而高剂量TGF-β₁（2.5ng／ml）则有促进VSMCs增生作用。3．与PDGF-BB（40ng／ml）刺激组相比，PDGF-BB（40ng／ml）联合中和性抗TGF-β₁抗体（20μg／ml）刺激后，VSMCs的增生及细胞内PCNA的表达均明显受到抑制。4．由CCK-8所检测的VSMCs增生的增量与由Western Blot所检测的PCNA表达的增量有高度的相关性（r=0.968，p＜0.01）。增量主要代表与正常对照组相比PDGF-BB所诱导的VSMCs增生和PCNA过表达的绝对增加量。结论1．在无血清状态下，PDGF-BB对VSMCs的增生起诱导作用，呈剂量依赖性增加，与PDGF-BB促进细胞内PCNA的表达呈明显的相关性。2．PDGF-BB诱导的VSMCs的增生和PCNA的表达部分是通过刺激VSMCs过表达TGF-β₁而起作用。3．在无血清状态下，低剂量TGF-β₁可抑制VSMCs增生，而高剂量TGF-β₁则有促进VSMCs增生的作用。