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共刺激分子4-1BBL属于TNF家族成员,4-1BBL与其受体4-1BB相互作用介导双向信号传导在免疫应答启动和调控过程中发挥重要作用。既往研究表明4-1BBL以膜型和可溶型的方式存在。4-1BBL表达于活化的T细胞、B细胞、树突状细胞、单核巨噬细胞、自然杀伤细胞表面。4-1BBL也可表达于多种肿瘤细胞表面。细胞膜4-1BBL分子可经金属蛋白酶切割脱落,形成可溶型的4-1BBL。课题组前期研究提示4-1BBL分子可能定位分布于肠癌细胞核。因此,本研究通过RT-PCR、基因测序、Western blot法和激光共聚焦显微镜观察确认了4-1BBL在肠癌细胞的表达和亚组分中的分布,并利用4-1BBL基因敲除肠癌细胞,探讨了核定位4-1BBL对肠癌细胞生物学行为的影响。第一部分4-1BBL在结直肠癌细胞中的分布目的:确认4-1BBL分子在肠癌细胞中的表达,并探讨4-1BBL在肠癌细胞亚组分中的分布。方法:选取人肠癌细胞 DLD1、HCT 116、RKO、SW480、HT29,采用 RT-PCR检测4-BBL在肠癌细胞mRNA水平上的表达;RT-PCR产物测序分析,是否存在4-1BBL的基因突变。采用Western blot法和免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜观察检测肠癌细胞亚组分中4-1BBL分子的分布。结果:①RT-PCR结果显示4-1BBL在DLDL1等肠癌细胞mRNA水平上均有表达。RT-PCR产物核酸测序分析结果显示,DLDL1等肠癌细胞中4-1BBL基因未突变。②蛋白质印迹法和免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜观察检测结果发现,DLD1等肠癌细胞4-1BBL均表达于细胞核,在细胞膜和细胞质中少表达或者几乎不表达。结论:4-1BBL表达于肠癌细胞株,且定位于肠癌细胞核。肠癌细胞株4-1BBL基因未发生突变。第二部分4-1BBL基因敲除对肠癌细胞生物学行为的影响目的:探讨核定位4-1BBL对肠癌细胞生物学行为的影响。方法:采用课题组利用CRISPER/CAS9技术建立的4-1BBL基因敲除人肠癌细胞株DLD1/4L KO和对照组细胞株DLD1/Cas9 only,通过细胞计数法、划痕愈合实验、transwell实验检测两株细胞的增殖和迁移能力。采用Realtime PCR检测两株细胞Wnt通路相关基因的表达。利用裸鼠体内肿瘤模型观察两株细胞成瘤率、肿瘤生长曲线、瘤体大小以及质量。结果:①生长曲线实验测定DLD1/Cas9 only和DLD1/4L KO细胞的增殖速度,结果显示DLD1/4LKO组明显比对照组细胞增长减慢(P=0.0003)。②划痕愈合实验结果显示,在24 h、48 h、72 h,DLD1/4LKO细胞的待愈合百分比均比对照组高,DLD1/4L KO细胞相对于DLD1/Cas9 only愈合缓慢。Transwell检测细胞迁移能力。观察24 h时,DLD1/4LKO组发生迁移的细胞数明显比DLD1/Cas9 only对照组少(P=0.0002)。③4-1BBL基因敲除肠癌细胞DLD1/4LKO的Wnt相关基因slug、c-myc、CD44、cyclinDl、cox2和mmpl0的mRNA表达水平下调。④体内实验结果显示,对照组DLDl/Cas9 only成瘤率是100%,实验组DLD1/4L KO成瘤率是85.7%。肿瘤生长曲线图显示DLD1/4LKO组比对照组DLD1/Cas9 only生长速度明显减慢(P<0.01)。DLD1/4L KO 组瘤体质量为 21.71±7.393 mg,DLD1/Cas9 only 组瘤体质量为162.3±33.16 mg,DLD1/4LKO组瘤体质量明显比对照组减小(P=0.0014)。结论:体内外实验结果表明,肠癌细胞核内4-1BBL基因敲除,使肠癌细胞增殖减慢、迁移能力减弱、体内生长减慢。细胞核内4-1BBL分子可能通过调控Wnt通路,参与肠癌恶性生物学行为。