α-酮异戊酸（α-ketoisovalerate）作为一种支链酮酸,是重要的医药中间体,被广泛应用于合成临床药物α-酮酸片,治疗尿毒症。利用代谢工程策略构建α-酮异戊酸合成重组菌株,实现α-酮异戊酸高效合成,势必促进其商业应用。本文在大肠杆菌中,通过协调α-酮异戊酸合成途径中的三个关键基因的表达、删除其竞争代谢途径编码基因、协调辅酶循环,实现了α-酮异戊酸的高效发酵合成;进一步通过设计和构建氧调控开关,实现了简单发酵工艺下,以高产量、高转化率发酵合成α-酮异戊酸。本文的主要研究结果如下:（1）协调关键酶的表达。克隆了α-酮异戊酸合成途径中的三个关键酶编码基因,分别是来源于B.subtilis 168的乙酰乳酸合成酶编码基因alsS、来源于E.coli MG1655的乙酰乳酸异构还原酶编码基因ilvC和二羟基酸脱水酶编码基因ilvD,在质粒上进行过量表达。优化三个基因在质粒上的排列顺序,以及终止子的添加位置,通过比较三酶体系体外转化丙酮酸合成α-酮异戊酸的能力,筛选获得了最优重组质粒pC_TSD_T。重组菌E.coli BL21（DE3）/pC_TSD_T,发酵16 h可产生1.5 g·L^-1α-酮异戊酸,跟重组质粒未优化前相比,产量提高3.4倍。（2）删除竞争代谢途径。以敲除了副产物乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸合成基因的菌株B0016-050为出发菌株,进一步敲除α-酮异戊酸合成的竞争及分解途径基因,如支链氨基酸转氨酶B基因（ilvE）、异丙基苹果酸合酶基因（leuA）和苏氨酸脱水酶基因（ilvA）,并整合T7 RNA聚合酶编码基因。结果表明,删除ilvE和leuA可以有效提高α-酮异戊酸合成水平。重组菌050T3/pC_TSD_T经26 h摇瓶发酵,可产生8.5 g·L^-1α-酮异戊酸,与重组菌E.coli BL21（DE3）/pC_TSD_T相比,产量提高4.7倍。（3）协调辅酶循环并进行发酵优化。克隆大肠杆菌来源的吡啶核苷酸转氢酶基因pntAB,构建NADPH再生系统。精细调节染色体上pntAB的表达水平,获得最优菌株050T4/pC_TSD_T,对其进行发酵条件优化,获得最优发酵条件为:摇瓶培养转速为200r·min^-1,菌体生长至OD₆₀₀为2.5时开始诱导,添加IPTG终浓度为0.4 mmol·L^-1。在该条件下,发酵36 h,α-酮异戊酸产量可达19.2 g·L^-1,α-酮异戊酸对葡萄糖的摩尔转化率为0.80 mol·mol^-1。（4）氧开关调控提高α-酮异戊酸转化率。构建微氧调控开关,调控α-酮异戊酸合成途径和丙酮酸消耗途径。敲除了阻遏蛋白编码基因lacI,并用微氧启动子Pst调节染色体上T7 RNA聚合酶的表达;用微氧启动子Psc调控人工合成sRNA的表达,进而调控丙酮酸脱氢酶lpd基因的表达。获得菌株050T8/pC_TSD_T-1经100 r·min^-1摇瓶微氧发酵,α-酮异戊酸对葡萄糖的摩尔转化率提高为0.85 mol·mol^-1,在微氧发酵阶段,其转化率达到0.98 mol·mol^-1,接近于理论转化率,单位细胞生产强度比好氧发酵菌株050T4/pC_TSD_T提高33.3%。