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目的:非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)是一种无饮酒史或饮酒折合乙醇量男性每周<140g,女性每周<70g,以肝细胞弥散性脂肪变、气球样变和肝小叶炎症和(或)中央静脉、窦周胶原沉积等为临床病理特点的慢性肝脏疾病[1],与肥胖、2型糖尿病、高血压、高脂血症等代谢综合征关系密切,是代谢紊乱在肝脏的一种病理表现[2]。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)是丝裂原活化蛋白激酶家族中的重要成员之一,是介导细胞外刺激到细胞内反应的重要信号转导系统。在NASH的发生发展中,小肠细菌过度生长,门静脉内毒素增加,通过Toll样受体信号激活JNK,推测激活的JNK通过使转录因子c-jun磷酸化,激活下游炎症相关基因释放多种促炎因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα, TNFα),导致肝组织炎症的发生。本实验通过对大鼠进行高脂饲料喂养成功建立NASH大鼠模型,并应用微生态制剂-双歧杆菌乳杆菌三联活菌(金双歧)灌胃干预,研究非酒精性脂肪性肝炎发展过程中大鼠肝组织JNK、c-Jun的表达情况及其与肝组织病理改变、血清TNFα、血浆内毒素表达水平等的关系,揭示JNK在NASH发病机制中的作用,为上述推测寻找部分证据,从而为NASH的防治提供新的靶点。方法:选用健康清洁级3-4周龄雄性Wistar大鼠36只随机分为以下六组:a正常对照组6只:标准饲料适应性喂养1周后处死取材;b高脂8周组6只:高脂饲料(83%普通饲料+2%胆固醇+10%猪油+5%玉米油)喂养8周;c高脂12周组6只:高脂饲料(83%普通饲料+2%胆固醇+10%猪油+5%玉米油)喂养12周;d高脂16周A组6只:高脂饲料(83%普通饲料+2%胆固醇+10%猪油+5%玉米油)喂养16周;e高脂16周B组6只:高脂饲料(83%普通饲料+2%胆固醇+10%猪油+5%玉米油)喂养16周,同时于12周时给予生理盐水(与金双歧干预剂量相同)灌胃4周;f金双歧干预组6只:高脂饲料(83%普通饲料+2%胆固醇+10%猪油+5%玉米油)喂养16周,并于12周时给予金双歧(400mg/kg·d)灌胃4周;分别于造模0、8、12、16周末隔夜空腹、股动脉放血处死,采集血清、血浆及大鼠肝组织,用于生化指标检测、普通病理、免疫组化染色和逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)测定。实验数据以x±s表示,单因素方差分析前进行正态性及方差齐性检验,Least-Significant-Difference法进行组间比较,双侧P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为有显著统计学意义。相关性分析采用直线相关分析法。应用SPSS 13.0统计软件分析实验数据。结果:1大鼠的一般情况:正常对照组大鼠精神状态良好,食欲旺盛,皮毛柔亮;高脂组大鼠精神不振,食欲逐渐减退,皮毛欠柔亮,体重明显增加;金双歧干预组大鼠精神、食欲、皮毛及体重介于正常对照组与高脂16周B组之间。2各组大鼠生化指标、血浆内毒素及血清TNFα水平变化:高脂8、12周、16周A组大鼠血清TC(2.782±0.312、3.455±0.324、3.865±0.183)、TG(0.693±0.115、0.855±0.104、1.018±0.133)、ALT(63.435±15.853、85.087±14.250、102.948±12.264)、AST(94.553±7.087、118.442±12.838、153.435±13.346)、血浆内毒素(0.815±0.107、1.327±0.209、2.157±0.238)、血清TNFα(11.157±2.703、21.333±4.077、28.223±2.885)水平均高于正常对照组(1.843±0.216、0.430±0.109、38.400±12.128、70.447±5.354、0.478±0.092、6.127±1.239),且随着造模时间的延长逐渐升高(P值均<0.01);金双歧干预组上述各指标(3.287±0.360、0.838±0.136、81.057±15.508、104.400±12.268、1.275±0.341、19.73±2.885)均较高脂16周B组( 3.842±0.200、1.037±0.151、102.953±12.545、154.408±14.218、2.153±0.257、28.375±2.198)明显下降(P值分别<0.05、<0.05、<0.05、<0.01、<0.01、<0.01)。3肝组织病理学变化:肉眼观,正常对照组大鼠肝脏呈红褐色,质地较软,有光泽;高脂组大鼠肝脏体积逐渐增大,边缘变钝,颜色逐渐由红褐色变为浅黄色,切面油腻感;金双歧干预组大鼠肝脏外观介于正常对照组和高脂16周B组之间。光镜下,HE染色可见正常对照组大鼠肝组织内大小一致的肝细胞围绕肝小叶中央静脉呈放射状分布,肝索结构完整;高脂8周大鼠肝组织中少量肝细胞出现气球样变,高脂12周大鼠肝组织显示少量炎细胞浸润和肝细胞的点状坏死,高脂16周A、B组大鼠肝细胞均肿胀,炎症程度加重,坏死范围扩大;金双歧干预组大鼠肝细胞气球样变、炎症活动度、坏死程度均较高脂16周B组明显改善。Masson染色显示正常对照组、高脂8周、12周组大鼠肝小叶中央静脉及汇管区周围均未见胶原纤维,高脂16周A、B组大鼠肝组织内部分中央静脉、窦周及汇管区周围可见胶原纤维沉积;金双歧干预组大鼠肝组织纤维化程度较高脂16周B组明显降低。SudanⅣ染色显示正常对照组大鼠肝细胞胞浆呈蓝色,无红色脂滴;高脂8周、12周组肝细胞胞浆内逐渐出现红染颗粒,且随着造模时间的延长逐渐增多;高脂16周A、B组大鼠均可见肝细胞内充满红色脂滴,肝组织弥漫性脂肪变性;金双歧干预组大鼠肝组织脂肪变程度较高脂16周B组显著降低。4肝组织JNK mRNA、c-Jun mRNA的表达:RT-PCR检测在正常肝组织内JNK mRNA、c-jun mRNA表达量较少(分别为0.319±0.027、0.299±0.039),随着高脂饮食喂养时间的延长,JNK mRNA表达量(0.439±0.039、0.569±0.031、0.645±0.032)、c-jun mRNA表达量(0.385±0.063、0.525±0.074、0.611±0.033)均逐渐增加(P值均<0.01)。金双歧干预组JNK mRNA(0.439±0.057)、c-jun mRNA(0.367±0.062)表达较高脂16周B组(0.645±0.027、0.611±0.029)大鼠肝组织明显减少(P值均<0.01),差异有显著统计学意义。5肝组织JNK、磷酸化JNK( phosphor-JNK, P-JNK )表达:以P-JNK/JNK比值表示大鼠肝组织JNK的活性,肝组织免疫组化染色显示大鼠肝组织JNK活性随着造模时间的延长(1.698±0.118、2.215±0.065、2.376±0.047、2.617±0.064)逐渐增强(P<0.01)。金双歧干预组大鼠肝组织中P-JNK/JNK比值(2.279±0.067)较高脂16周B组(2.610±0.063)明显减少(P<0.01),差异有显著统计学意义。6相关性分析:各组大鼠NASH模型肝组织JNK活性即P-JNK/JNK比值与血清TNFα水平和血浆LPS水平呈正相关,相关系数分别为r =0.776(P <0.01)、r =0.868(P <0.01)。结论:1应用高脂饮食饲养大鼠可以成功复制NASH大鼠模型,其中血清TNFα及血浆内毒素在NASH发生发展中起着关键作用。2在NASH大鼠模型的肝组织中JNK活性随着造模时间的延长逐渐增强,下游转录因子c-jun磷酸化逐渐增多,与血清TNFα及血浆内毒素水平呈正相关,提示JNK信号通路参与肝脏炎症的发生,在NASH的进展中起重要作用。3微生态制剂可补充肠道正常菌群,抑制肠源性内毒素血症、TNFα的合成和释放,改善肝脏炎症,可能是通过抑制JNK信号转导通路,减少P-JNK的表达,从而达到防治非酒精性脂肪性肝病的作用。