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目的:EHD2(C-Terminal EH domain-containing protein 2)蛋白是一类参与受体内吞和转运的新型膜转运调控蛋白。据报道EHD2可以与质膜结合,提高其稳定性,并限制其凹陷和内吞囊泡的形成。近年来,EHD2与肿瘤的关系开始受到人们的关注。本实验室在研究中发现EHD2在乳腺肿瘤中的表达及定位与乳腺癌的增殖、侵袭、迁移能力具有密切的相关性。免疫组化统计结果显示,EHD2核定位的患者预后较好,相反,EHD2在细胞浆/膜高表达的患者多出现临床分期较高,而且易发生远处转移,预后较差等现象。并且我们在前期研究中发现EHD2参与人表皮生长因子受体EGFR的内吞转运。基于以上研究结果,本课题将进一步探讨EHD2是否通过对EGFR的调节作用而影响E-cadherin在细胞中的表达,进而影响乳腺癌的侵袭迁移能力,介导乳腺癌的EMT。此外,我们将进一步研究膜转运调控蛋白EHD2是否直接参与E-cadherin的内吞转运。为进一步探讨E-cadherin的胞内调控机制和完善信号转导通路提供基础,并为抑制恶性肿瘤的EMT提供新的靶点。方法:1.利用western blot技术检测几种乳腺癌细胞系中目标蛋白的表达水平,选取合适的细胞系。2.应用PCR技术构建携带非融合荧光蛋白的EHD2小RNA干扰质粒si EHD2//cop GFP、EHD2野生型(EHD2-WT-HA//cop GFP),带有融合荧光蛋白的EHD2-WT-m Cherry、EHD2-I157Q-m Cherry,EHD2-T94A-m Cherry等过表达质粒。3.应用si EHD2//cop GFP抑制Bcap37中EHD2的表达,western blot检测EHD2、EGFR、E-cadherin的表达情况。应用AG1478(EGFR、Her2靶向双酪氨酸蛋白激酶抑制剂)前后:体外划痕及transwell实验观察降表达EHD2对细胞迁移能力的影响,Western blot检测EHD2降表达对正常培养和无钙培养4小时条件下E-cadherin表达水平的影响。4.应用慢病毒感染Bcap37过表达EHD2-WT-HA。应用AG1478前后:体外划痕及transwell实验观察细胞迁移能力的改变。应用AG1478前后,Western2.应用PCR技术构建携带非融合荧光蛋白的EHD2小RNA干扰质粒si EHD2//cop GFP、EHD2野生型(EHD2-WT-HA//cop GFP),带有融合荧光蛋白的EHD2-WT-m Cherry、EHD2-I157Q-m Cherry,EHD2-T94A-m Cherry等过表达质粒。3.应用si EHD2//cop GFP抑制Bcap37中EHD2的表达,western blot检测EHD2、EGFR、E-cadherin的表达情况。应用AG1478(EGFR、Her2靶向双酪氨酸蛋白激酶抑制剂)前后:体外划痕及transwell实验观察降表达EHD2对细胞迁移能力的影响,Western blot检测EHD2降表达对正常培养和无钙培养4小时条件下E-cadherin表达水平的影响。4.应用慢病毒感染Bcap37过表达EHD2-WT-HA。应用AG1478前后:体外划痕及transwell实验观察细胞迁移能力的改变。应用AG1478前后,Westernblot检测EHD2过表达对正常培养和无钙培养4小时条件下E-cadherin表达水平的影响。5.免疫荧光技术分别观察Bcap37中内源EHD2与E-cadherin的定位情况,及激光共聚焦观察EHD2与E-cadherin的共定位。6.MCF-7中过表达EHD2-WT-HA。应用AG1478前后:Western blot检测过表达EHD2-WT-HA后在正常培养及无钙培养4小时条件下E-cadherin表达水平。利用免疫沉淀技术(IP)获得过表达EHD2组和对照组中的E-cadherin,western blot检测其泛素化水平。7.利用EHD2-WT-m Cherry、EHD2-T94A-mCherry、EHD2-I157Q-mCherry质粒转染MCF-7细胞系,免疫荧光检测其与内源E-cadherin定位情况,及Ecadherin内吞情况。8.用慢病毒感染MCF-7过表达E-cadherin-copGFP后,在分别过表达EHD2-WT-m Cherry、EHD2-I157Q-m Cherry,利用免疫荧光技术观察无钙培养不同时间点,EHD2-WT-m Cherry、EHD2-I157Q-m Cherry与E-cadherincop GFP及内源clathrin在细胞内的定位情况。结果:1.根据Western blot检测结果选择Bcap37和MCF-7细胞系作为实验对象。2.成功构建的质粒:plsi EHD2-46-cop GFP;plsi Ctrl-cop GFP;p CDH-EHD2-HA//cop CFP;p CDH-blasticidin-EHD2-m Cherry;p CDH-blasticidin-EHD2-T94A-m Cherry p CDH-blasticidin-EHD2-I157Q-m Cherry。3.EHD2小RNA干扰后,Bcap37中EGFR的表达水平降低,E-cadherin的表达水平提高,同时抑制了细胞迁移。应用AG1478抑制EGFR信号通路后EHD2降表达组中E-cadherin表达略上升,细胞迁移抑制更明显。但EHD2降表达不影响撤Ca2+后E-cadherin的降解。4.Bcap37细胞中过表达EHD2-WT-HA后,(1)western blot结果显示:(1)普通培养条件下(Ca2++/AG1478-)EHD2过表达组EGFR表达水平升高,E-cadherin表达下降。(2)无钙培养4小时条件下(Ca2+-/AG1478-),与同实验条件下的对照组相比,EHD2过表达组E-cadherin下降更为明显。(3)应用AG1478后(Ca2++/AG1478+),EHD2过表达组E-cadherin表达升高,显著高于同等处理条件的对照组。(4)应用AG1478后,无钙培养4小时(Ca2+-/AG1478+),E-cadherin表达下降,但EHD2过表达组E-cadherin表达水平显著高于对照组。(2)体外划痕及transwell实验结果显示:EHD2过表达组细胞迁移能力强于对照组,应用AG1478后抑制了细胞迁移,EHD2过表达组细胞迁移能力弱于对照组。5.在Bcap37细胞中内源EHD2核定位及膜定位明显,外源EHD2-WT-HA与E-cadherin在胞膜共定位。6.MCF-7中过表达EHD2-WT-HA使E-cadherin表达上升,并抑制其降解。7.在MCF-7中EHD2与E-cadherin共定位,参与E-cadherin的内吞转运。7.在MCF-7中EHD2与E-cadherin共定位,参与E-cadherin的内吞转运。8.结果显示在MCF-7中EHD2-WT-mCherry在无钙培养0时间点时与Ecadherin-cop GFP和clathrin在质膜共定位且与自发内吞E-cadherin-cop GFP和clathrin的在胞浆共定位;1h时间点EHD2-WT-m Cherry与E-cadherincop GFP和clathrin的在胞浆中以大量囊泡形式共定位。无钙培养0时间点时EHD2-I157Q-m Cherry与E-cadherin-cop GFP及内源clatherin在细胞内以囊泡形式共定位。结论:1.EHD2可以通过调节EGFR、E-cadherin影响乳腺癌EMT。2.EHD2通过调节EGFR影响E-cadherin。3.EHD2作为膜转运调控蛋白直接参与E-cadherin的内吞转运,抑制E-cadherin降解。4.EHD2对E-cadheirn表达水平调节的最终结果受到该细胞中EGFR表达水平和活性的影响。