目的与意义癫痫(Epilepsy, EP)是神经系统常见的慢性疾病,病程长且反复发作。流行病学表示,在世界范围内癫痫患者约占1%,而我国每年癫痫的发病率约23/10万左右,估计现有癫痫病人约455万-630万人。现阶段临床上对癫痫的治疗仍以口服抗癫痫药物为主。现代抗癫痫药物(AEDS)都是人工合成的化学性药物,目前可控制约80%患者的癫痫发作,但患者需要长期甚至终身服药治疗。然而化学合成药物不可避免其毒副作用,多数AEDS会对神经系统、消化系统及血液系统产生不良影响,患者可能会出现头晕、乏力、恶心、呕吐以及血小板减少等一系列症状。再者,随着服药时间的增长,多数患者耐药性不断提高,只能加大药物剂量或者更换新药,这样无形之中提高了治疗成本,且副作用加大。因此不断寻找新的抗癫痫药物非常有必要,尤其是从中药中开辟新的途径。中药防治癫痫具有缓效,作用时间长,副作用少,毒副反应轻等特点。近年来中药抗癫痫治疗逐渐成为热点,某些药物已在临床取得明显疗效。癫痫属于中医“痫症”范畴,又名“羊角风”。因其发病与先天因素相关,故有“胎病”之称。其病因病机,中医认为与先天因素、六淫疫毒、痰浊内生、七情失调、脑窍外伤等有关。因先天因素或外邪致风阳、痰浊、瘀血蒙蔽清窍,气机逆乱,脑神失养导致癫痫发作。病位在脑,涉及肝、脾、肾三脏。中医药治疗癫痫已有上千年历史,且取得一定疗效,现代医家在继承传统方药治法的基础上不断创新,进一步丰富了癫痫的证治内容。主要论治要法大体可分为“从肝论治”“从痰论治”“从脾论治”“从瘀论治”“从肾论治"等。本课题组认为肝脏功能的异常与癫痫的发作有着密不可分的关系。肝为风木之脏,其气升发,喜条达而恶抑郁,主筋,开窍于目。肝主疏泄而藏血,肝气顺畅,则诸脏腑、经络调和,气血运行正常；若肝气郁滞,水津运化失调,聚而生痰,痰浊随气上逆,痹阻经络,蒙蔽清窍则导致病人神昏或抽搐发作。此外,肝藏血,血属阴,倘若阴血不足,则不能遏制阳旺,从而导致阳化风动；肝血不足,不可养筋,则也会出现肢体抽搐。若肝旺以致升发太过,会生风动火,煎熬津液,既则结而为痰,风动痰升,阻塞清窍,而出现昏仆抽搐。历代医家在古籍中都有以上观点的陈述。《黄帝内经素问·卷二十一》日：“木发之郁,太虚埃昏,大风乃至,屋发折木……甚则耳鸣眩转,目不识人,善暴僵仆。”这是一段描写癫痫从肝论治的理论基础。《三因极一病症方论》说：“夫癫痫病,皆由惊动,使脏气不平,郁而生涎,闭塞诸经,撅而乃成。”也说明了癫痫的病因在于肝的疏泄失职。《内经·大奇论》曰：“肝脉小急,痫瘛痉挛。”《儒门事亲·痫》曰：“大凡风痫病发,项强直视,不省人事,此乃肝经有热也。”《素问·至真要大论》云：“诸风掉眩,皆属于肝。”故治肝是治疗癫痫疾病的关键所在。本课题组自拟中药复方柴胡桂枝汤,以疏肝理气,镇肝潜阳之功效在临床治疗癫痫疾病取得显著疗效。川芎作为为传统中药,已广泛应用到神经系统及心脑血管系统疾病的治疗中,其提取物川芎嗪具有改善循环,扩张血管,抗血小板聚集等多项作用,故在同类药物的筛选中更具有优势。因不同的癫痫模型作用部位及作用机制不同,可用于探讨抗癫痫药物的作用机制也不同。既往有关川芎嗪抗癫痫的研究仅仅建立某一种癫痫模型去证实川芎嗪的抗癫痫作用,不够全面系统。本课题组参考国内外成熟的癫痫模型研究,结合自身实验特点,并通过预实验摸索建模所需药物剂量,学习模型动物的饲养及护理方法,最后成功建立四种不同的癫痫模型,并从行为学方面系统评价了川芎嗪抗癫痫的作用。对既往的相关研究进行了证实与补充。方法与内容1.最大电惊厥癫痫模型的建立1.1材料实验动物选取昆明种小鼠,体重18-22g,雄性,由南方医科大学动物实验中心提供。仪器采用YSD-4G药理生理实验多用仪,由安徽正华生物仪器设备有限公司生产。1.2方法实验前24h作最大电惊厥的筛选,即用两鳄鱼夹分别夹住小鼠双耳尖部,预实验确定定95%以上动物强直性惊厥发作的参数为(100V；20Hz)以后肢强直性伸直为指标,阳性者入选。选取符合惊厥标准的昆明小鼠60只,每组15只,分成4组。分别腹腔注射NS、TMP200、400、800mg/kg,于给药后1h、2h、3h、4h、5h分别测定最大电惊厥的小鼠只数。以探究川芎嗪抗癫痫作用的时量效关系。结果见图3-1。再次选取符合惊厥标准的昆明小鼠50只,每组10只,分成5组。随机分为模型组、川芎嗪高、中、低剂量组和安定组。按TMP200、400、800mg/kg剂量灌胃给药,模型组给予等体积的生理盐水,安定组用生理盐水配成0.4mg/ml的溶液。给药60min后,电刺激1次,计算各组小鼠发生惊厥只数及惊厥发生率。结果见表3-1。2.戊四氮小鼠急性癫痫模型的建立2.1材料实验动物选取昆明种小鼠,体重18-22g,雄性,由南方医科大学动物实验中心提供。戊四氮注射液购自Sigama公司,安定(地西泮注射液)由天津金耀氨基酸有限公司提供。2.2方法预实验确定95%以上动物出现阵挛性抽搐的戊四氮剂量,用生理盐水配成8.5mg/ml溶液。选取小鼠50只,每组10只,随机分为模型组、川芎嗪高剂量组、中剂量组、低剂量组和安定组。按TMP200、400、800mg/kg剂量灌胃给药,模型组给予等体积的生理盐水,安定组用生理盐水配成0.4mg/ml的溶液。给药60min后,腹腔注射相应剂量的戊四氮注射液。观察指标采用Racine标准,0级：无反应；Ⅰ级：节律性口角、耳或面部肌肉抽动阵挛；Ⅱ级：点头并伴随更严重的面部肌肉抽动阵挛；Ⅲ级：出现前肢阵挛但不伴随直立；Ⅳ级：前肢阵挛伴随直立；V级：全身强直阵挛发作而跌倒。给药后持续观察30min,记录小鼠阵发性痉挛发作的潜伏期(1-3级的发作时间),强直性惊厥(5级发作)的小鼠只数,大于30min小鼠死亡的只数,同时计算惊厥发作率和死亡保护率。结果见表3-2和图3-2。3.士的宁小鼠急性癫痫模型的建立3.1材料实验动物选取昆明种小鼠,体重18～22g,雄性,由南方医科大学动物实验中心提供。士的宁注射液购自Sigama公司,安定(地西泮注射液)由天津金耀氨基酸有限公司提供。3.2方法预实验确定95%以上动物出现阵挛性抽搐的士的宁剂量,用生理盐水配成0.2mg/ml溶液。选取小鼠50只,每组10只,随机分为模型组、川芎嗪高剂量组、中剂量组、低剂量组和安定组。按TMP200、400、800mg/kg剂量灌胃给药,模型组给予等体积的生理盐水,安定组用生理盐水配成0.4mg/ml的溶液。给药60min后,腹腔注射相应剂量的士的宁注射液,持续观察30min,观察指标同前。记录小鼠阵发性痉挛发作的潜伏期,强直性惊厥的小鼠只数,大于30min小鼠死亡的只数,同时计算惊厥发作率和死亡保护率。结果见表3-3和图3-3。4.匹罗卡品小鼠急性癫痫模型的建立4.1材料实验动物选取昆明种小鼠,体重18～22g,雄性,由南方医科大学动物实验中心提供。匹罗卡品注射液购自Sigama公司,安定(地西泮注射液)由天津金耀氨基酸有限公司提供。4.2方法预实验确定95%以上动物出现阵挛性抽搐的匹罗卡品剂量,用生理盐水配成40mg/ml溶液。选取小鼠50只,每组10只,随机分为模型组、川芎嗪高剂量组、中剂量组、低剂量组和安定组。按TMP200、400、800mg/kg剂量灌胃给药,模型组给予等体积的生理盐水,安定组用生理盐水配成0.4mg/ml的溶液。给药60min后,腹腔注射相应剂量的匹罗卡品注射液,持续观察30min,观察指标同前。记录小鼠阵发性痉挛发作的潜伏期,强直性惊厥的小鼠只数,大于30min小鼠死亡的只数,同时计算惊厥发作率和死亡保护率。结果见表3-4和图3-4。5统计学方法采用spss13.0统计软件对上述观察结果进行分析处理。计量资料用均数±标准差表示,多样本的均数的比较急两样本均数的比较用方差分析,计数资料及率的比较用卡方检验,P<0.05均表示有统计学意义。结果1.TMP对最大电惊厥急性小鼠癫痫模型的结果1.1TMP抗惊厥作用的时量效关系于腹腔注射川芎嗪后,0.25h时,低剂量川芎嗪组有1只小鼠未出现惊厥发作,MES的惊厥抑制率为7%；中剂量川芎嗪组有3只小鼠未出现惊厥发作,MES的惊厥抑制率为20%；高剂量川芎嗪组有8只小鼠未出现惊厥发作,MES的惊厥抑制率为53%。1h时,低剂量川芎嗪组有2只小鼠未出现惊厥发作,MES的惊厥抑制率为13%；中剂量川芎嗪组有8只小鼠未出现惊厥发作,MES的惊厥抑制率为53%,高剂量川芎嗪组有11只小鼠未出现惊厥发作,MES的惊厥抑制率为73%。结果表明川芎嗪抗惊厥作用于0.25h即开始起效,0.5～1h时达到峰值,4h时作用基本消失。具体见图3-1。1.2TMP对最大电惊厥急性小鼠癫痫模型的结果在最大电惊厥实验中,模型组10只小鼠中有9只出现惊厥发作,惊厥率为90%,川芎嗪中剂量组10只小鼠中有8只出现惊厥发作,惊厥率为30%,川芎嗪高剂量组10只小鼠中仅有2只出现惊厥发作,惊厥率为20%。由此可见,中、高剂量川芎嗪组的惊厥率明显低于模型组的惊厥率。说明川芎嗪可明显降低最大电惊厥小鼠惊厥率(P<0.01或P<0.05)具体见表3-1。2.TMP对戊四氮小鼠急性癫痫模型的结果2.1TMP对戊四氮小鼠痫性发作潜伏期的影响与模型组相比较,中、高剂量川芎嗪组均能够明显延长小鼠阵发性痉挛发作的潜伏期,且三组之间的比较差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)说明中、高剂量川芎嗪可以延长戊四氮诱发的小鼠痫性发作的潜伏期。具体见表3-2。2.2TMP对戊四氮致痫小鼠强直性惊厥发生率的影响模型组小鼠在戊四氮诱导下强直性惊厥的发生率为100%,中、高剂量川芎嗪组的强直性惊厥率分别为50%和20%,均低于模型组的强直性惊厥率,且三组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)说明中、高剂量川芎嗪均可以降低戊四氮所致的实验性癫痫小鼠强直性惊厥发生率,且存在一定量效关系。具体见图3-2。2.3TMP对戊四氮致痫小鼠死亡时间及死亡保护率的影响模型组小鼠死亡时间大于30分钟的小鼠只数为0,死亡保护率为0%,中剂量川芎嗪组小鼠死亡时间大于30分钟的小鼠只数为5,死亡保护率为50%,高剂量川芎嗪组小鼠死亡时间大于30分钟的小鼠只数为6,死亡保护率为60%,中、高剂量川芎嗪组的死亡保护率均高于模型组,且三组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)说明中、高剂量川芎嗪均可以延长戊四氮所致癫痫小鼠的死亡时间。具体见图3-2。3.TMP对的宁小鼠急性癫痫模型的结果3.1TMP对士的宁小鼠痫性发作潜伏期的影响与模型组相比较,中、高剂量川芎嗪组均能够明显延长小鼠阵发性痉挛发作的潜伏期,且三组之间的比较差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)说明中、高剂量川芎嗪可以延长士的宁诱发的小鼠痫性发作的潜伏期。具体见表3-3。3.2TMP对戊四氮致痫小鼠强直性惊厥发生率的影响模型组小鼠在士的宁诱导下强直性惊厥的发生率为100%,中、高剂量川芎嗪组的强直性惊厥率分别为50%和30%,均低于模型组的强直性惊厥率,且三组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)说明中、高剂量川芎嗪均可以降低士的宁所致的实验性癫痫小鼠强直性惊厥发生率,且存在一定量效关系。具体见图3-3。3.3TMP对士的宁致痫小鼠死亡时间及死亡保护率的影响模型组小鼠死亡时间大于30分钟的小鼠只数为0,死亡保护率为0%,中剂量川芎嗪组小鼠死亡时间大于30分钟的小鼠只数为5,死亡保护率为50%,高剂量川芎嗪组小鼠死亡时间大于30分钟的小鼠只数为7,死亡保护率为70%,中、高剂量川芎嗪组的死亡保护率均高于模型组,且三组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)说明中、高剂量川芎嗪均可以延长士的宁所致癫痫小鼠的死亡时间。具体见图3-3。4.TMP对匹罗卡品小鼠急性癫痫模型的结果与模型组相比较,高剂量川芎嗪组能够明显延长小鼠阵发性痉挛发作的潜伏期,与模型组相比较差异有统计学意义(P<0.05)中剂量川芎嗪组小鼠死亡只数大于30分钟的小鼠只数为2,死亡保护率为20%,高剂量组小鼠死亡时间大于30分钟的小鼠只数为2,死亡保护率为20%,与模型组之间无统计学意义。说明高剂量川芎嗪仅可以延长匹罗卡品诱发的小鼠痫性发作的潜伏期。具体见表3-4,图3-4。结论本实验通过建立四种不同的急性小鼠癫痫模型从行为学角度对TMP抗癫痫作用进行系统论证,得出以下结论：中、高剂量TMP能明显减少癫痫小鼠MES发作次数,延长戊四氮、士的宁所致小鼠阵挛潜伏期,同时延长癫痫小鼠的死亡时间。高剂量TMP可延长小鼠匹罗卡品癫痫模型的阵挛时间。由此推测川芎嗪对于临床癫痫全身阵挛强直性发作效果明显。对于失神性癫痫发作、颞叶癫痫发作有效。且存在一定时量效关系。