核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus)是一类对节肢类动物有专一侵染性的双链环状DNA的病毒,其宿主大多数为鳞翅目和膜翅目的昆虫。家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是一种专一侵染家蚕的杆状病毒,一方面BmNPV对蚕业生产具有很强的破坏性,另一方面,BmNPV-家蚕是一种高效的生物反应器。因此,深入研究BmNPV-家蚕细胞的侵染互作关系模型,无论是对病毒防治,还是药用蛋白的高效生产都具有积极作用。近年来,越来越多的研究结果表明:蛋白质的翻译后修饰在生物体的生命活动中发挥着极其重要的调控作用。本课题组在近期的有关蛋白质翻译后修饰差异组学研究中发现,在BmNPV感染宿主Bm N细胞36h后,多种病毒蛋白的乙酰化修饰水平均发生了变化,其中晚期表达因子-11(Late expression factor 11,LEF-11)是乙酰化水平显著下调最为显著的蛋白之一(其第83位Lys位点下调0.768倍)。已有的研究表明lef-11是BmNPV基因组编码的晚期表达因子之一,是病毒DNA复制的必需基因,基因大小为336 bp,编码112个氨基酸,分子量约13.1 k Da,存在于大多数已知的杆状病毒基因组中,是调控病毒生命活动的重要功能基因,但其乙酰化修饰在BmNPV侵染过程中的作用还未见报道。为了深入研究LEF-11的K83位点乙酰化修饰(Kac)在病毒侵染过程中可能的调控机制,本课题首先利用Red重组技术,将BmNPV中原有的lef-11基因敲除,然后利用定点突变技术,通过设计含有模拟(去)乙酰化突变位点的引物,PCR扩增获得含特异性赖氨酸位点发生突变的lef-11基因,插入转移载体p Fastbac1中,再利用Bac-to-Bac技术分别补回缺失的基因(或突变基因),获得lef-11基因异位补回型重组病毒及其突变体。将敲除型病毒、补回型及其突变体DNA分别转染Bm N细胞即可获得子代病毒,再感染家蚕细胞进行病毒滴度检测。结果显示:lef-11敲除后,细胞不发病,表明该基因为BmNPV复制的必须基因;而LEF-11的K83位点的乙酰化修饰对子代病毒的产生具有一定的促进作用。进一步利用荧光定量q PCR技术,检测BmNPV基因组DNA的复制情况,结果进一步证实了LEF-11的K83位点的乙酰化对病毒基因组的复制具有促进作用。此外,为了探究乙酰化修饰对LEF-11核定位的影响,本实验将LEF-11与EGFP蛋白进行融合表达,结果显示K83位点的乙酰化会影响LEF-11的核定位的功能。为了进一步深入了解LEF-11的K83位点乙酰化修饰对其与相关蛋白相互作用的影响,后利用酵母双杂交技术,检测了LEF-11乙酰化对LEF-3、IE-1以及自身相互作用情况,结果显示:乙酰化会减弱LEF-11的自身相互作用,同时乙酰化突变也会影响其与LEF-3和IE-1的相互作用。本研究将为深入了解BmNPV侵染宿主家蚕细胞的互作机制奠定基础,同时也有可能为家蚕的抗病毒研究提供新思路。