研究背景随着人口老龄化进程的不断加深,脑血管疾病已经成为危害中老年人健康的常见病、多发病,因其发病具有高发病率、高致残率、高复发率等特点,故而脑缺血损伤后神经的再生修复一直是神经科学领域内研究的热点和难点。目前越来越多的研究表明,若置于合适的微环境中,受损伤的神经元轴突是可以再生的。中药复方因其具有独特的临床疗效,多元的作用靶点,日益成为神经领域研究的重点。通络化痰胶囊在“化痰通络汤”的基础上总结优化而成,目前已在临床用于治疗脑梗死。在前期研究基础上,本文运用细胞生物学和分子生物学技术,研究通络化痰胶囊对于Nogo-A、GAP-43蛋白表达情况以及胶质细胞增生情况、Neurocan表达情况的影响,从而探讨其对神经轴突再生的影响,为推广应用于发生脑缺血损伤的创伤性失血性休克、创伤性弥漫性脑肿胀和蛛网膜下腔出血等疾病提供理论依据。研究目的1通过对脑缺血损伤后的MCAO模型大鼠应用通络化痰胶囊,研究不同浓度通络化痰胶囊水溶剂对大鼠脑缺血损伤后Nogo-A蛋白、GAP-43蛋白表达的影响。2在体外实验中研究不同浓度的通络化痰含药血清对胶质细胞增生情况以及与胶质细胞增生高度相关的Neurocan因子表达情况的影响,从而探讨其对神经轴突再生的影响。研究方法1将48只大鼠随机分为正常组、模型组、通络化痰胶囊低剂量组以及通络化痰胶囊高剂量组。造模:实验组动物参照Koizumi法制作大鼠大脑中动脉缺血模型(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO),予大鼠颈前作前正中切口,细心游离颈总、颈外、颈内动脉,结扎右侧颈总动脉近心端、颈外动脉及颈内动脉颞颚分支,仅保留颈内动脉入颅主干。于颈总动脉分叉处插入4-0尼龙线,沿颈内动脉推进17～18mm时可感阻力,表明栓线头己通过大脑中动脉起始处,实现大脑中动脉阻塞,扎紧颈动脉远心端缝线,尼龙线外留1cm,缝合皮肤,缺血1h后轻轻提拉残留线头至有阻力,提示尼龙线头端已至颈总动脉切口处,实现大脑中动脉再灌注,造模完成。以大鼠清醒后出现同侧Horner征及对侧肢体偏瘫(前肢为重)为造模成功标志。造模成功后每天低、高剂量组分别予通络化痰胶囊溶液324mg/kg、648mg/kg灌胃,模型组予生理盐水灌胃,空白组不作任何处理。于7天、14天两个时间点分别处死各组大鼠6只并取脑,应用免疫组化法检测Nogo-A、GAP-43表达水平,采用图像获取分析软件尼康NIS-ElementsD 3.0测定阳性表达物的平均光密度积分,所得数据采用SPSS23.0软件包处理,数据统一以均数±标准差(x±s)的形式表示,统计方法采用单因素方差分析(One-way ANOVA),P<0.05表示差异有统计学意义。2将大鼠随机分为正常组及通络化痰胶囊组。其中通络化痰胶囊组每天以通络化痰水溶液648mg/kg灌胃1次,连续7天。第7天灌胃2小时后股动脉取血,4℃静置,2000r/min离心10mins,取上清液,经56℃,30mins灭活,灭菌,零下20℃保存。选取正常组血清以及通络化痰胶囊灌胃组的血清分别制备10%,5%,2.5%血清浓度的培养基。对不同浓度含药血清培养的大鼠原代细胞神经胶质细胞进行体外培养,应用划痕实验,待星形胶质细胞长满培养皿底的时候,使用消毒后的200微升枪头的尖部在培养皿底划伤星形胶质细胞,形成损伤带,继续培养,观察不同浓度含药血清对神经胶质细胞迁移的影响,并应用Western blot技术测定Neurocan的表达情况。研究结果1在构建大鼠脑缺血再灌注模型,给予通络化痰胶囊溶液灌胃后,与模型组同期相比通络化痰胶囊高、低剂量组均能降低Nogo-A的表达(P<0.05 或P<0.01),上调GAP-43的表达(P<0.05),但通络化痰高、低剂量组之间上述2指标的表达水平未见明显差异。2从划伤实验结果来看,尽管含药血清对损伤的大鼠原代神经胶质细胞并未能产生完全的抑制作用,但用药浓度梯度增加时,胶质细胞仍表现出一定的生长抑制趋势;对体外培养的大鼠原代神经胶质细胞进行了连续21天含药血清培养后总蛋白抽提检测Neurocan,表明最高含药血清培养细胞中Neurocan蛋白的含量出现了一定程度的下降。研究结论通络化痰胶囊能够上调脑缺血区GAP-43蛋白表达,抑制Nogo-A蛋白的表达,具备一定的抑制胶质瘢痕形成的能力,从而起到促进神经轴突再生的作用。