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目的探讨以羊膜为载体,自体皮下培植兔角膜缘干细胞(Limbal stem cells, LSCs)的可行性。观察培养的兔角膜缘干细胞联合新鲜羊膜移植治疗兔眼角膜缘干细胞缺乏性功能障碍(limbal stem cell deficiency,LSCD)的疗效。方法健康新西兰大白兔55只,所有兔均取左眼角膜上方,角巩膜缘灰白色交界处,2mm×3mm×lmm大小的角膜缘组织块,用新鲜羊膜反折包裹后,埋植于自体左侧皮下腹斜肌表面血管网处。分别于1周、2周、3周、4周取出组织块进行病理切片(HE染色)、免疫组织化学(P63、E-cadherin)检查,判断角膜缘干细胞是否存活、增生或分化。通过碱烧伤方法,将兔右眼制成LSCD模型。将成功建立LSCD模型的50只兔随机分成5组：皮下培植角膜缘干细胞1周移植组(AM+LSC1W).皮下培植角膜缘干细胞2周移植组(AM+LSC2W).皮下培植角膜缘干细胞3周移植组(AM+LSC3W).皮下培植角膜缘干细胞4周移植组(AM+LSC4W)及单纯新鲜羊膜移植组(AM)。每组10只兔10只眼。实验组(即AM+LSC1W组、AM+LSC2W组、AM+LSC3W组、AM+LSC4W组)用皮下培植的角膜缘干细胞联合新鲜羊膜进行移植手术,对照组(AM组)用新鲜羊膜行手术。术后每周观察角膜透明度、角膜新生血管生成程度、睑球粘连情况,并记录角膜上皮愈合时间。于术后1月对角膜形态(角膜新生血管、角膜混浊度)进行评分,并摘除术眼,进行病理学(HE染色和PAS染色)检查。结果培养前期(1W),组织块细胞存活良好,多达10层以上的细胞,近似在体角膜缘细胞形态,层次分明。细胞间紧密连接。基底层的柱状细胞较多,P63强阳性表达,E-cadherin蛋白表达阴性。培养中期(2W、3W),培养的组织块存活良好。2W的组织块细胞出现细胞层次明显增多,基底层表达P63阳性的细胞较第1W增多明显,E-cadherin蛋白仍为阴性表达。3W时的组织块细胞E-cadherin蛋白表达阳性的细胞增多。而培养后期(4W)的组织块,细胞层数减少为4-5层,细胞形态为扁平细胞和翼状细胞多见,E-cadherin蛋白表达强阳性。角膜缘干细胞缺乏性功能障碍模型建立后,各组间眼表新生血管及混浊度评分无统计学差异(F=0.111P>0.05.F=0.265P>0.05).移植术后1月,AM+LSC1W组角膜上皮愈合时间(19.70±1.34)d、AM+LSC2W组(18.90±2.38)d、AM+LSC3W组(18.90±2.92)d.AM+LSC4W组(20.10±2.02)d、AM组(25.50±1.27)d,各实验组间无统计学差异,与AM组相比,角膜上皮愈合时间短,比较均有统计学差异。移植术后,AM+LSC1W组、AM+LSC2W组、AM+LSC3W组角膜眼表形态较术前明显改善,角膜新生血管减少,混浊度减轻(P<0.05).AM+LSC4W组及新鲜羊膜移植组术后眼表形态未得到明显改善(P>0.05).AM+LSC(2W)及AM+LSC(4W)组分别有1例出现睑球粘连。结论以羊膜为载体,短时间内行皮下培植角膜缘干细胞的方法是可行的。培植时间3周时,角膜缘干细胞开始出现分化。4周时,培植的角膜缘干细胞组织片近似于角膜上皮组织结构。皮下培植的角膜缘干细胞联合新鲜羊膜移植治疗兔眼LSCD,植片可以存活,术后可以促进角膜上皮的愈合,并能有效的阻止角膜新生血管生成,减轻角膜混浊程度。