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禽流感(AI)是由A型流感病毒引起禽类的一种急性、烈性传染病，它的流行与爆发给养禽业造成了巨大的经济损失。而防制禽流感的主要措施是使用禽流感灭活疫苗，但免疫禽群和野毒感染禽群同样会产生较高的抗体，所以如何区分免疫鸡群和感染鸡群成为当前面临的一大难题。本研究根据GenBank已经发表的H5N1亚型禽流感病毒(AIV)NS1基因序列，设计合成一对引物，利用RT-PCR方法扩增出了AIV的NS1基因，将其克隆到pMD-18T载体中，再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过PCR鉴定和酶切鉴定筛选出阳性克隆，测序鉴定。结果表明，所得到的阳性克隆质粒含有NS1基因，是正确插入到载体中的，通过核苷酸及其所推导的氨基酸序列比较，与GenBank上参考毒株的同源性分别为95.2％～99.7％和92.2％～98.7％。将克隆化的NS1基因亚克隆到pET-28a(+)原核表达载体上，得到的转化子经过PCR鉴定和酶切鉴定，构建了原核表达质粒pET／NS1，再将重组表达质粒转化宿主菌BL21，在37℃条件下，用终浓度为1mmol／L的IPTG诱导表达5h，经15％的SDS-PAGE分析，NS1蛋白以包涵体的形式表达，其分子量大约为28kD，说明NS1蛋白已在大肠杆菌中得到高效表达。经Western-blotting检测分析该表达产物可与AIV感染的发病鸡血清发生反应，证明该表达产物具有良好的反应原性。在优化了表达条件后，对重组蛋白进行了大量表达并纯化。以纯化的重组蛋白作为包被抗原建立了间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法，并对人工感染和疫苗免疫的鸡群进行检测。结果显示，该方法能检测到AI自然感染鸡所产生的抗体，而不能检测到灭活疫苗免疫鸡血清中的抗体。因此，NS1蛋白可作为一种鉴别诊断标记，区分野毒感染和灭活疫苗免疫鸡群，但不区分亚型，具有A型特异性。利用AIV非结构蛋白NS1基因表达抗原，建立的ELISA检测方法为生产提供了一种快速、特异的鉴别诊断方法，为进一步组装试剂盒奠定了基础，该方法的应用将为禽流感的早期诊断和控制提供行之有效的技术支持。