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目的研究从麒麟菜中提取天然海藻色素糖蛋白(Natural Seaweed Pigment Glycoprotein,英文简称NSPG)的方法并制备实验样品。应用红外、紫外分光法、液相-质谱法、凝胶色谱法等技术手段测定天然海藻色素糖蛋白样品的分子量及结构特征等指标,采用体外细胞培养和体内实验方法,观察麒麟菜天然海藻色素糖蛋白对H22肝癌的抑制作用。方法包括麒麟菜天然海藻色素糖蛋白的制备与分析,及其对肝癌抑制作用等实验方法：1NSPG的制备与分析1.1NSPG制备：将洗净的麒麟菜切为0.5-1.0cm的长条,置于pH3.0的盐酸溶液中浸提,将上述酸性浸提液进行减压抽滤,收集滤液调节pH至4.5,再加入3倍体积的95%的乙醇,搅拌,放置过夜,析出沉淀,真空抽滤得到滤纸上的沉淀部分,将沉淀分别部分用无水乙醇、丙酮洗涤,室温干燥,得NSPG。1.2NSPG组成与结构分析1.2.1NSPG多糖和蛋白质含量测定：以葡萄糖为标准物质,用硫酸-苯酚法测定NSPG中多糖的含量。以牛血清白蛋白为标准物质,用考马斯亮蓝法测定NSPG中蛋白质的含量。1.2.2NSPG结构分析：用紫外和红外光谱法测定多糖和蛋白质的特征吸收峰。根据β-消除反应和液-质谱法确定糖苷键的类型。1.2.3NSPG分子量测定：用凝胶色谱分析法测定NSPG的分子量。1.2.4感官等理化指标：包括形态、色泽与水溶性等指标测定。2NSPG对肝癌的抑制作用研究2.1体外实验：对肝癌细胞增殖活性的抑制作用进行研究。将小鼠H22肝癌细胞和HepG2人肝癌细胞分别与不同剂量的NSPG(浓度分别为10mg/L、50mg/L、100mg/L)共同培养,另设不加NSPG的作为对照,用MTT法测定肝癌细胞增殖活性。2.2体内实验：对小鼠H22肝癌的抑制作用进行研究无菌条件下抽取接种H22肝癌细胞第6d的小鼠腹水,接种在50只体重为18-20g的健康昆明种小鼠的右侧腋窝处,每只皮下注射0.2ml。将接种的小鼠随机分5个组：肿瘤对照组、低、中、高剂量NSPG组和环磷酰胺组,每组十只,雌雄各一半。其中三个NSPG剂量组每日经口灌胃浓度分别为10、50、100mg/kg的水溶液,给对照组经口灌胃等量的生理盐水,环磷酰胺组小鼠隔日1次腹腔注射20mg/kg的环磷酰胺,连续10d。最后一次给药后第二天将小鼠称重→摘小鼠眼球取血,分离血清→取瘤组织、取脾脏和胸腺,用电子天平称量重量→剥取瘤组织备检。2.2.1瘤体比和抑瘤率：用电子天平称取小鼠体重、瘤重并计算瘤重与体重比值得出瘤体比、并计算抑瘤率。2.2.2胸腺指数和脾脏指数：取动物脾脏和胸腺,用电子天平称量重量,根据体重计算脾脏指数和胸腺指数。2.2.3血清肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α水平：摘小鼠眼球取血,分离血清后用ELISA法检测血清的TNF-α水平。2.2.4瘤细胞增殖活性：用四甲基偶氮唑(MTT)法检测各组小鼠肿瘤细胞的增殖活性。2.2.5瘤组织中PCNA、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平：用免疫组化法检测。结果麒麟菜天然海藻色素糖蛋白的制备与分析以及对肝癌抑制作用的研究结果如下：1NSPG的制备与分析1.1NSPG制备：建立了等电点沉淀法从麒麟菜提取天然海藻色素糖蛋白的方法并制备了足量的实验样品,已申请并获得国家发明专利证书。NSPG外观为棕红色粉末,溶于水,不溶于乙醇乙醚等有机溶剂,其提取得率为8.3%。1.2NSPG多糖和蛋白质含量测定：NSPG中多糖的含量为93.3%,蛋白质的含量为2.04%。1.3NSPG紫外光谱分析：在紫外光谱195nm出现多糖的特征吸收峰,其吸收值为1.834,在280nm处蛋白质的吸收值为0.417,但吸收峰不明显,说明蛋白质的含量较低。1.4NSPG红外光谱分析：从红外光谱可见1651cm-1有酰胺键的特征吸收。在1034cm-1附近有吸收峰,表明NSPG的糖苷类型为吡喃型。1.5NSPG糖苷键测定：NSPG经β-消除反应前后有紫外吸收的变化,说明NSPG中有O-连接糖苷键的存在。液-质谱图中各峰之间的差异为115,是天冬氨酸的分子量,说明NSPG中同时存在N-连接糖苷键。1.6NSPG分子量的测定：凝胶色谱分析结果,NSPG相对分子量为213.8KDa。2NSPG对肝癌的抑制作用研究2.1体外实验结果：HepG2人肝癌细胞培养48小时、小鼠H22肝癌细胞培养24小时,NSPG高、中、低3个剂量组对增殖活性的抑制作用均依次升高,差异有显著性意义(p<0.05),表明NSPG对小鼠H22肝癌细胞和HepG2人肝癌细胞的增殖活性均有一定的抑制作用。2.2体内实验结果2.2.1瘤体比和抑瘤率结果：NSPG高剂量组和对照组的平均瘤体比分别为0.31±0.05g和0.55±0.23g,两者有显著性差异(p<0.05); NSPG高剂量组肿瘤生长抑制率为43.64%,低剂量组肿瘤生长抑制率为9.10%,差异有显著性意义(p<0.05)。2.2.2胸腺指数和脾脏指数结果：NSPG高、中、低剂量组的胸腺指数和脾脏指数与对照组比较均有所增加,但环磷酰胺组与对照组、高、中、低剂量NSPG组比较,环磷酰胺组胸腺指数和脾脏指数显著降低,并与对照组比较差异有显著的统计意义(p<0.01)。2.2.3血清TNF-α水平结果：血清中NSPG高剂量组的TNF-α浓度为92.17±4.01pg/ml,TNF-α血清水平明显低于对照组和NSPG中、低剂量组,而且较对照组有显著性差异(p<0.05)。2.2.4瘤细胞增殖活性结果：用MTT法测定各组瘤细胞增殖活性水平结果高剂量和中剂量NSPG组瘤细胞增殖活性水平分别为0.71±0.03和0.83±0.02,对照组细胞增殖活性为1.14±0.03,高、中剂量NSPG组及其与对照组之间有显著性差异(p<0.05)。2.2.5PCNA蛋等白表达结果：PCNA蛋白表达水平结果对照组肝癌细胞PCNA蛋白阳性表达率为72.78%,高剂量NSPG组为28.32%,,二者差异有显著性意义(p<0.05)。NSPG高剂量组Bax和Bcl-2蛋白阳性表达率分别为38.10%和16.78%,对照组分别为4.68%和65.16%,两组间差异均存在显著性意义(p<0.05)。对照组的Caspase-3蛋白阳性表达率为5.00%,NSPG高剂量组为40.20%,有显著性差异(p<0.05)。结论通过上述实验结果对麒麟菜天然海藻色素糖蛋白的实验得出以下结论：1.建立了从麒麟菜中提取天然海藻色素糖蛋白的方法,得率为8.3%。麒麟菜天然海藻色糖蛋白的相对分子量为213.8KDa。海藻色素糖蛋白的多糖含量为93.3%,蛋白质含量为2.04%。糖苷键有O-连接糖苷键,同时存在N-连接糖苷键。2.麒麟菜天然海藻色素糖蛋白不仅在体外对HepG2人肝癌细胞增殖和小鼠H22肝癌细胞增殖具有一定的抑制作用,在体内对小鼠肝癌细胞的增殖也有显著的抑制作用,说明麒麟菜天然海藻色素糖蛋白能够抑制肝癌细胞的体内外增殖活性。3.麒麟菜天然海藻色素糖蛋白降低小鼠H22肝癌组织中Bcl-2和PCNA蛋白表达水平、促进肝癌细胞Bax和Caspase-3蛋白表达水平。证明通过抑制增殖和促进凋亡而抑制H22肝癌细胞的生长。4.麒麟菜天然海藻色素糖蛋白抑制血清TNF-α水平异常升高,使其维持在一定水平发挥抗肿瘤作用,进一步证明海藻色素糖蛋白对肝癌的抑制作用。5.环磷酰胺虽然对H22肝癌细胞有抑制作用,但环磷酰胺可损伤荷瘤动物的脾脏和胸腺从而导致免疫功能的衰退,而天然海藻色素糖蛋白不仅对H22肝癌细胞的增长有抑制作用,还对脾脏和胸腺有保护作用。这为麒麟菜的开发利用以及天然海藻色素糖蛋白在预防和治疗肝癌等疾病方面的应用提供科学依据。