第一部分：重组质粒pEGFP-N2/XPD转染条件的优化及Pifithrin-α孵育条件的优化目的：本部分为探讨XPD与P53两者对HBV复制、肝癌细胞增殖凋亡以及HBx表达的影响，所以事先有必要优化重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染条件和Pifithrin–α的孵育条件。方法：将HepG2.2.15细胞种植于6孔板中。种板后第2天，利用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N2/XPD分别按每孔0μg、2.0μg、4.0μg、6.0μg及8.0μg的浓度瞬时转染细胞。转染后48h收获细胞，进行RT-PCR和Western blot以检测XPD表达的变化。将重组质粒pEGFP-N2/XPD以上述得出的最佳浓度转染细胞，转染后分别孵育0h、24h、48h、72h及96h收获细胞，进行RT-PCR和Westernblot以检测XPD表达的变化。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况。在Pifithrin-α终浓度分别为0μM、10μM、20μM、30μM及40μM的条件下孵育细胞12h，然后进行MTT检测。以上述得出的最佳浓度的Pifithrin-α分别孵育细胞0h、12h、24h、36h及48h，然后进行MTT检测。结果：1．质粒转染浓度的优化RT-PCR和Western blot结果显示，XPD的表达在质粒浓度分别为每孔0μg、2μg、4μg范围内呈剂量依赖性升高（P <0.05），其中4μg时XPD的表达为最高（P <0.05）。而每孔为4μg、6μg、8μg三者之间相比，XPD的表达无统计学差异（P＞0.05），即质粒浓度达到4μg/孔以后XPD的表达不再随浓度的增加而继续升高。因此，在后续的实验中选定4μg/孔为质粒转染的浓度。2．质粒转染后细胞孵育时间的优化RT-PCR结果显示，XPD mRNA的表达在质粒转染后细胞孵育时间分别为0h、24h、48h范围内呈时间依赖性升高（P <0.05），而在48h、72h、96h范围内呈时间依赖性降低（P <0.05），其中48h时XPD mRNA的表达为最高（P<0.05）。Western blot结果显示，XPD蛋白的表达在质粒转染后细胞孵育时间分别为0h、24h、48h、72h范围内呈时间依赖性升高（P <0.05），而在96h时回落（P <0.05），其中72h时XPD蛋白的表达为最高（P <0.05）。在后续的实验中选定48h为质粒转染后细胞孵育时间。3．质粒转染成功的鉴定转染48h后，在荧光显微镜下，可在转染了重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2的细胞中观察到绿色荧光，而未转染质粒的细胞则未见绿色荧光，即转染成功。4．Pifithrin–α孵育浓度的优化MTT结果显示，A值在Pifithrin–α浓度分别为0μM、10μM、20μM范围内呈剂量依赖性升高（P <0.05），其中20μM时A值为最高（P <0.05）。而浓度为20μM、30μM、40μM三者之间相比，A值无统计学差异（P＞0.05），即Pifithrin–α浓度达到20μM以后细胞增殖活力不再随浓度的增加而继续升高。因此，在后续的实验中选定20μM为Pifithrin–α的孵育浓度。5．Pifithrin–α孵育时间的优化MTT结果显示，A值在Pifithrin–α孵育时间分别为0h、12h、24h范围内呈时间依赖性升高（P <0.05），其中24h时A值为最高（P <0.05）。而孵育时间为为24h、36h、48h三者之间相比，A值无统计学差异（P＞0.05），即Pifithrin–α孵育时间达到24h以后细胞增殖活力不再随孵育时间的增加而继续升高。因此，在后续的实验中选定24h为Pifithrin–α的孵育时间。结论：本部分确定，在后续的实验中，将以浓度为4μg/孔的pEGFP-N2/XPD质粒转染HepG2.2.15细胞，转染后的第2天以浓度为20μM的Pifithrin–α孵育细胞24h,转染后共孵育细胞48h后收获细胞。第二部分：XPD通过P53抑制乙型肝炎病毒的复制目的：本部分研究XPD和P53两者对HBV复制的影响。方法：将HepG2.2.15细胞种植于6孔板中。种板后第2天，利用脂质体转染法将浓度为4μg/孔重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2瞬时转染HepG2.2.15细胞。转染后第2天，给予20μM的Pifithrin-α孵育24h收获细胞。实验分为5组：（1）空白对照组；（2）pEGFP-N2组；（3）pEGFP-N2/XPD组；（4）pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组；（5）Pifithrin-α组。用RT-PCR检测HepG2.2.15细胞的XPD、HBsAg及HBeAg mRNA的变化；用Elisa法检测培养上清液中HBsAg和HBeAg的含量；用荧光定量PCR法检测培养上清液中HBV-DNA的含量。结果：1. XPD和P53对HBsAg、HBeAg mRNA表达的影响RT-PCR检测发现，与空白对照组和转染空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组和pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组的XPD mRNA的表达明显增多（P均<0.001）；与空白对照组和转染空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的HBsAg和HBeAg mRNA的表达明显减少（P均<0.001）；与空白对照组相比，Pifithrin-α处理组的HBsAg和HBeAg mRNA的表达明显增多（P均<0.05）；与转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组相比，pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组的HBsAg和HBeAg mRNA的表达明显增多（P均<0.001）；而空白对照组与转染空载质粒pEGFP-N2组之间相比，差异无统计学意义（P均>0.05）。2. XPD和P53对培养上清液中HBsAg和HBeAg含量的影响Elisa检测发现，与空白对照组和转染空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的培养上清液中HBsAg和HBeAg含量明显减少（P均<0.001）；与转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组相比，pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组的培养上清液中HBsAg和HBeAg含量明显增多（P均<0.001）；而空白对照组、转染空载质粒pEGFP-N2组与Pifithrin-α组三者之间相比，差异无统计学意义（P均>0.05）。3. XPD和P53对培养上清液中HBV-DNA含量的影响荧光定量PCR检测发现，与空白对照组和转染空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的培养上清液中HBV-DNA含量明显减少（P均<0.001）；与转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组相比，pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组的培养上清液中HBV-DNA含量明显增多（P <0.001）；而空白对照组、转染空载质粒pEGFP-N2组与Pifithrin-α组三者之间相比，差异无统计学意义（P均>0.05）。结论：XPD能通过P53途径抑制HBV的复制。因此，XPD和P53可能成为乙型肝炎抗病毒治疗的作用靶点。第三部分：XPD通过P53抑制肝癌的增殖目的：本部分研究XPD和P53两者对肝癌细胞增殖凋亡的影响。方法：用脂质体转染法将浓度为4μg/孔重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2转染HepG2.2.15细胞。转染后第2天给予浓度为20μM的Pifithrin-α孵育细胞24h。实验分为5组：（1）空白对照组；（2）pEGFP-N2组；（3）pEGFP-N2/XPD组；（4）pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组；（5）Pifithrin-α组。用MTT法观察细胞增殖活力；用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。结果：1.细胞增殖活力的变化MTT结果显示，空白对照组、 pEGFP-N2组、 pEGFP-N2/XPD组、pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组和Pifithrin-α组的A值分别为0.655±0.136、0.633±0.119、0.114±0.055、0.528±0.076及0.934±0.201，差异有统计学意义（F=64.783，P <0.001）。重组质粒pEGFP-N2/XPD组的A值明显低于空白对照组和空载质粒pEGFP-N2组（P均<0.001）；Pifithrin-α处理组的A值明显高于空白对照组（P <0.001）；pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组的A值明显高于重组质粒pEGFP-N2/XPD组（P <0.001）；而空白对照组与空载质粒pEGFP-N2组之间相比，差异无统计学意义（P=0.680）。2.细胞周期的变化流式细胞仪结果显示，空白对照组、pEGFP-N2组、pEGFP-N2/XPD组、pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组和Pifithrin-α组的G1期细胞分别占总细胞数的81.15%±2.31%、80.81%±1.88%、91.08%±2.90%、79.75%±1.79%及74.78%±2.01%（F=42.985，P <0.001），G2期细胞分别占总细胞数的4.75%±1.16%、4.58%±1.07%、0.32%±0.42%、3.73%±1.76%、6.97%±0.39%（F=29.592，P <0.001），S期细胞分别占总细胞数的14.10%±1.74%、14.61%±1.97%、8.60%±2.53%、16.52%±1.91%及18.25%±1.73%（F=19.954，P <0.001），差异均有统计学意义。与空白对照组和空载质粒pEGFP-N2组相比，重组质粒pEGFP-N2/XPD组的G1期细胞明显增多（P均<0.001），G2期和S期细胞明显减少（P均<0.001）；与空白对照组相比，Pifithrin-α处理组的G1期细胞明显减少（P <0.001），G2期和S期细胞明显增多（P均<0.01）；与重组质粒pEGFP-N2/XPD组相比，pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组的G1期细胞明显减少（P <0.001），G2期和S期细胞明显增多（P均<0.001）；而空白对照组与转染空载质粒pEGFP-N2组之间相比，G1期细胞（P=0.794）、G2期（P=0.787）和S期细胞（P=0.662）差异均无统计学意义。3.细胞凋亡率的变化流式细胞仪结果显示，空白对照组、pEGFP-N2组、pEGFP-N2/XPD组、pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组和Pifithrin-α组的凋亡细胞分别占总细胞数的5.72%±0.64%、6.33%±1.12%、36.43%±3.12%、13.66%±2.18%及2.12%±0.80%，差异有统计学意义（F=341.606，P <0.001）。转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的细胞凋亡率明显高于空白对照组和空载质粒pEGFP-N2组（P均<0.001）；Pifithrin-α处理组的细胞凋亡率明显低于空白对照组（P=0.002）；pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组的细胞凋亡率明显低于转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组（P<0.001）；而空白对照组与转染空载质粒pEGFP-N2组之间相比，差异无统计学意义（P=0.570）。结论XPD抑制肝癌细胞生长和促进肝癌细胞凋亡的作用是通过P53途径实现的。第四部分：XPD通过P53抑制HBx的表达目的：本部分研究XPD和P53两者对HBx、P21、Bax、Bcl-2基因表达的影响。方法：用脂质体转染法将浓度为4μg/孔重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2转染HepG2.2.15细胞。转染后第2天给予浓度为20μM的Pifithrin-α孵育细胞24h。实验分为5组：（1）空白对照组；（2）pEGFP-N2组；（3）pEGFP-N2/XPD组；（4）pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组；（5）Pifithrin-α组。用RT-PCR检测XPD、HBx、P21、Bax和Bcl-2表达量的变化；用Western blot检测XPD、P53、p-P53(ser-15)、HBx、P21、Bax和Bcl-2表达量的变化。结果：1. XPD、HBx、P21、Bax和Bcl-2mRNA表达的变化RT-PCR检测发现，pEGFP-N2/XPD的转染明显增加了XPD mRNA的表达（P <0.001）；与空白对照组和转染空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的P21和Bax mRNA的表达明显增多，而Bcl-2和HBx mRNA的表达明显减少（P均<0.001）；与空白对照组相比，Pifithrin-α处理组的P21和Bax mRNA的表达明显减少，而Bcl-2和HBx mRNA的表达明显增多（P均<0.01）；与转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组相比，pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组的P21和Bax mRNA的表达明显减少，而Bcl-2和HBx mRNA的表达明显增多（P均<0.001）；空白对照组与转染空载质粒pEGFP-N2组之间相比，差异无统计学意义（P均>0.05）。2. XPD、P53、p-P53(ser-15)、HBx、P21、Bax和Bcl-2蛋白表达的变化Western blot检测发现，pEGFP-N2/XPD的转染明显增加了XPD蛋白的表达（P <0.001）；与空白对照组和转染空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的P53、p-P53(ser-15)、P21和Bax蛋白的表达明显增多，而Bcl-2和HBx蛋白的表达明显减少（P均<0.01）；与空白对照组相比，Pifithrin-α处理组的P53、P21和Bax蛋白的表达明显减少，而Bcl-2和HBx蛋白的表达明显增多（P均<0.05），但是p-P53(ser-15)的表达却无明显区别（P=0.909）；与转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组相比，pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组的P53、p-P53(ser-15)、P21和Bax蛋白的表达明显减少，而Bcl-2和HBx蛋白的表达明显增多（P均<0.001）；空白对照组与转染空载质粒pEGFP-N2组之间相比，差异无统计学意义（P均>0.05）。结论：XPD能通过P53途径上调P21和Bax的表达并下调HBx和Bcl-2的表达。同时也表明，XPD、P53和HBx三者之间能相互作用、相互影响，共同调节肝癌的发生与发展。