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禽流感(avian influenza,AI)是由正黏病毒科(Orthomyxoviridae)A型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)引起的禽类急性传染病。该病于1878年,由Perronicito首次报道在意大利发生的病例,目前在世界范围内广为流行,给养禽业造成了巨大的经济损失。因此,开展对高致病性禽流感病毒的研究,从分子水平掌握禽流感病毒H5N1亚型的流行规律和致病机理,不仅在病毒学、兽医学等学科上有重要的学术意义,而且在公共卫生等方面也具有重大的社会意义。
禽流感病毒基因组核酸在病毒增殖过程中很容易发生重排而产生抗原漂移和抗原转变现象,在禽流感病毒编码的各种蛋白质中,以血凝素(hemagglutinin,HA)基因的突变率最高。禽流感病毒的抗原性和致病性在很大程度上取决于该基因的变异情况。HA在病毒吸附及穿膜过程中起关键作用。因此HA基因已经成为禽流感病毒研究的热点并取得了许多突破性的进展。血凝素发挥功能之前必须裂解为两条肽链HA1和HA2,其裂解位点的氨基酸残基的组成是决定禽流感病毒致病力高低的主要因素。禽流感病毒毒力强弱主要体现在血凝素的裂解位点的变化,因此对血凝素裂解位点的研究一直是热点。
长期以来,人们对禽流感病毒的研究和关注主要集中在HA蛋白质。HA蛋白质具有重要的生物学意义,这已经为很多实验所证明。但对编码HA蛋白质的模板mRNA的研究和关注却是少之又少,主要是由于mRNA在活细胞内与蛋白质结合紧密,致使mRNA的分离、提取、纯化都很不容易,而纯化了的裸mRNA的降解速度又很快,乃至结晶十分不易。由于RNA实验测定条件的限制以及在实验方法学上尚未取得实质性突破,导致精细三维结构,尤其是全长mRNA的折叠结构难以直接用实验方法测定。
本研究工作主要围绕禽流感血凝素mRNA核苷酸的二级结构展开,分别对高致病亚型H5N1和主要是低致病性但有部分毒株是高致病性的H5N2亚型的禽流感病毒HA蛋白裂解位点碱性氨基酸对应的mRNA核苷酸片段的二级结构特征进行研究和分析。旨在探讨裂解位点氨基酸对应的mRNA核苷酸片段的二级结构特征与病毒致病力的关系,希望能对禽流感病毒的研究提供一些基础性信息,且能够产生一定的社会效益。
本研究以从GenBank中选取的H5N1和H5N2亚型禽流感病毒毒株为样本,以HA蛋白裂解位点的碱性氨基酸对应的mRNA核苷酸的二级结构为研究对象。我们采用等步长递增方法,用软件RNAstructLire 4.1对HA蛋白裂解位点的碱性氨基酸对应的mRNA核苷酸的动态延伸折叠二级结构进行预测,然后分析其结构特点。为了检验RNAStructure 4.1预测结构的准确度我们又用软件STAR对其结果进行了随机抽样检验。同时也对裂解位点碱性氨基酸的密码子偏好性进行了统计分析,且做了一个裂解位点碱性氨基酸——精氨酸的密码子的替换实验。结果表明:①碱性氨基酸对应的mRNA片段上的核苷酸主要位于折叠二级结构的单链环区,极少数位于配对螺旋区。②裂解位点的碱性氨基酸对富含腺嘌呤(adenine,A)的密码子具有强烈偏好。通过对这些病毒样本mRNA核苷酸片段的折叠二级结构与其感染毒力的对照和比较,从理论上提出了一种防治AIV的对策。