梨褪绿叶斑伴随病毒（Pear chlorotic leaf spot-associated virus,PCLSaV）是我国近年新鉴定出的一种负义RNA病毒,属于欧洲山梣环斑病毒属（Emaravirus）,其基因组至少由5条负义单链RNA组成。由PCLSaV引起的梨褪绿叶斑病（pear chlorotic leaf spot,PCLS）在我国局部砂梨产区发生普遍,严重影响梨的生长。本研究建立了PCLSaV的逆转录重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）技术以及实时荧光定量RT-PCR（RT-qPCR）技术;采用茎尖培养、电疗处理与化学处理结合的方法,进行该病毒脱除研究,建立了实用的脱毒技术体系。研究结果为该病毒病害的早期诊断和无病毒种质培育提供了技术支撑。取得的主要研究结果如下:1.PCLSaV的RT-RPA检测。基于PCLSaV的RNA3链和RNA5链的序列设计了7对引物,采用常规RT-PCR筛选出特异性较好的引物R3-F1/R1。对带有不同病毒的梨叶片样品进行RT-RPA分析,仅从PCLSaV阳性样品中扩增到大小为243bp的目的条带,即该引物特异性良好。RPA方法可检测到稀释数为10-7倍的含该病毒RNA3部分片段序列的质粒,灵敏度与PCR相当。对38份田间梨叶片和32份梨离体植株叶片样品进行检测,RT-RPA方法检出了37份阳性样品,检出率为52.9%;RT-PCR方法检出了41份阳性样品,检出率为58.6%,两种方法检测结果一致率为91.4%。RT-RPA所需设备简单,反应速度快,只需在39℃下反应20 min,可用于该病毒的快速检测。2.PCLSaV的RT-qPCR检测。基于PCLSaV的RNA3和RNA5链的序列设计了8对引物,经常规RT-PCR和RT-qPCR分析筛选出特异性较好的引物q5-F2/R2,优化了RT-qPCR的引物用量和退火温度。建立了标准曲线,循环Ct值与模板浓度线性关系良好（R~2=0.997）,扩增效率为91.9%。该方法对PCLSaV特异性强,与其他常见的梨病毒无交叉反应。检测质粒的灵敏度为3.0×10~3拷贝/μL,是常规PCR的10倍。研究发现PCLSaV在梨植株上分布不均匀,梨病株的不同样品中PCLSaV的含量存在显著差异,发病叶片中的病毒拷贝数相对较高,不显症枝条的韧皮部中病毒拷贝数最低。同一病枝上的嫩叶中PCLSaV含量高于老叶,其中表现褪绿斑点和坏死症状的顶端嫩叶中病毒拷贝数最高,无症状的下部老叶中病毒拷贝数最低。对32份田间梨叶片和46份梨离体植株叶片样品进行检测,在23份有症状叶片中,RT-qPCR和RT-PCR分别检出23份和22份阳性样品;在55份无症状叶片中,RT-qPCR和RT-PCR分别检出19份和13份阳性样品。3.梨离体植株中PCLSaV的脱除。以砂梨‘丰水’离体植株为试验材料,比较了4种方法脱除PCLSaV的效果。结果显示,茎尖培养、病毒醚处理结合茎尖培养、电疗处理结合茎尖培养以及病毒醚加电疗处理结合茎尖培养这4种方法脱除PCLSaV的效率分别为30.0%、47.4%、44.4%以及76.5%。采用病毒醚加电疗处理结合茎尖培养对其他4个梨品种离体植株中的PCLSaV、ASGV和ASPV进行脱除试验的结果显示,‘康弗伦斯’植株中PCLSaV的脱除率为85.7%,‘康弗伦斯’、‘巴梨’和‘色尔克甫’植株中ASGV的平均脱除率为52.3%,‘康弗伦斯’和‘金香水’植株中的ASPV脱除率为100%。本研究首次将电疗处理用于梨病毒的脱除,为梨无病毒种质培育提供了新的技术支撑。