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胰腺癌是一种高度恶性的肿瘤,其组织学类型约95%为胰腺导管腺癌,5年生存率仅为3%。现阶段手术切除仍是临床上治疗胰腺导管腺癌最有效的方法,但由于胰腺癌隐匿性较强,初期无明显特殊体征,致使患者确诊较晚,多数患者失去了手术机会,这是导致胰腺癌患者低生存率的原因之一。因此探究胰腺癌发生发展的机制,从而找到更有效的诊断和治疗方法,对于胰腺癌患者的远期预后至关重要。miRNA是长度为18-25个核苷酸的小非编码RNA,其可以作为致癌基因或抑癌基因在肿瘤的发生发展中起着不同的作用。有研究证明miRNA可以通过调控多个靶基因或由多个miRNA调控一个靶基因来影响疾病的发展进程。miRNA的这些正性或负性的调控作用与癌症的发生发展有着密切的联系。本研究旨在探讨miR-193a-3p在胰腺导管腺癌组织及细胞中的表达水平,及其对胰腺导管腺癌细胞在增殖和侵袭方面的作用和影响;并利用预测软件发现miR-193a-3p与靶基因CCND1拥有碱基结合序列。通过实验研究miR-193a-3p与靶基因CCND1两者的相关性,为下一步胰腺癌的相关机制的研究,以及寻找更好的诊断和治疗方法提供理论及实验基础。材料和方法1、收集广西医科大学第一附属医院病理科2012年1月至2017年6月胰腺导管腺癌蜡块组织37例、正常胰腺胰腺蜡块组织42例,通过qRT-PCR检测miR-193a-3p及CCND1的表达水平,并通过受试者工作特征(ROC)曲线分析其与胰腺癌的病理诊断联系。从GEO和Arrayexpress数据库上查找并下载检测PDAC组织中miR-193a-3p和CCND1的表达芯片,从芯片中提取胰腺导管腺癌组织与正常胰腺组织中miR-193a-3p、CCND1的表达数据,结合从临床收集的胰腺导管腺癌组织中检测到的miR-193a-3p、CCND1的表达水平数据进行META分析,从更大的样本量上探讨miR-193a-3p和CCND1在胰腺导管腺癌中的表达水平的联系。2、通过qRT-PCR检测实验,对比PDAC细胞系BxPC-3、PANC-1、AsPC与胰腺正常细胞系Hped6-C7中miR-193a-3p和CCND1的基因表达水平。3、应用慢病毒感染过表达miR-193a-3p的方法,在胰腺癌细胞系BxPC-3及PANC-1细胞中过表达miR-193a-3p后,通过CCK8细胞增殖、细胞周期及凋亡、transwell细胞迁移及小室侵袭等实验,研究miR-193a-3p对胰腺导管腺癌细胞增殖、凋亡及侵袭的影响。4、运用miRwalk靶基因预测网站(包含12个预测网站)预测miR-193a-3p的靶基因,并在DAVID上进行GO(Gene Ontology)分析及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析,在String上进行靶基因的蛋白互作网络分析。5、根据检测的胰腺癌组织中miR-193a-3p和CCND1的表达数据,分析miR-193a-3p与CCND1的表达相关性的大小,使用生物信心学靶标预测软件寻找miR-193a-3p和CCND1之间是否存在基因互补序列。6、通过过表达miR-193a-3p,检测CCND1的表达水平,然后对比阴性对照组,明确两者是否有明显差异,miR-193a-3p与CCND1的直接靶向结合关系通过应用双荧光素酶基因报告实验验证。结果1、在37例PDAC和42例正常胰腺组织中,通过PCR实验进行对比,本研究发现miR-193a-3p在PDAC组织中的表达明显低于正常的胰腺组织,ROC曲线下面积(AUC=0.662,p=0.013)提示miR-193a-3p的低表达与胰腺导管腺癌具有一定的相关性。通过检索GEO和Arrayexpress数据库,获取3张检测PDAC与正常胰腺组织中miR-193a-3p表达的基因芯片,通过分析3张芯片数据,研究发现miR-193a-3p的表达在PDAC低于正常胰腺组织。结合本课题组检测的表达数据进行meta分析,结果提示miR-193a-3p在PDAC组织中的表达量显著低于正常胰腺组织(SMD=-0.57,CI=-0.84--0.31,p<0.001)并具有诊断意义(SROC AUC=0.74)。在人胰腺腺癌细胞系PANC-1、BxPC-3、AsPC-1及正常胰腺导管上皮细胞系Hped6-C7中,应用荧光定量PCR的方法检测miR-193a-3p的表达水平情况,结果显示miR-193a-3p在三株胰腺腺癌细胞中的表达均明显低于正常胰腺细胞(P<0.05)。在BxPC-3及PANC-1细胞中用病毒感染过表达miR-193a-3p后,细胞的增殖受到了明显的抑制、细胞凋亡的趋势有明显的加速,以及细胞周期被阻滞在G1及G2/M期。2、选取重复出现在大于7个数据库中的基因,共有285个基因进行后续研究。将这285个基因进行GO分析,得到71条信号通路,其中9条有意义(P≤0.01)。进行KEGG通路分析,得到37条通路,其中14条有意义(P≤0.01)。进行蛋白互作网络分析,总共有12个基因与CCND1相连,并且在多种肿瘤的通路中均有富集,所以选取CCND1进行下一步的研究。3、在胰腺癌组织中对CCND1的表达水平进行检测,分析结果显示在这37例PDAC蜡块组织中CCND1呈现明显的高表达趋势(P=0.029)。通过检索GEO和Arrayexpress数据库,获得了11张检测PDAC与正常胰腺组织中CCND1表达的基因芯片,通过分析发现11张芯片数据均提示CCND1的表达在PDAC高于正常胰腺组织。结合本课题组检测的表达数据进行meta分析,结果提示CCND1在PDAC组织中的表达量显著高于正常胰腺组织(SMD=0.69,CI=0.38-0.99,p<0.001)并有显著的诊断意义(SROC AUC=0.74)。4、利用miRanda靶基因预测软件发现,miR-193a-3p和CCND1存在碱基互补序列。并且CCND1的表达水平在过表达miR-193a-3p的胰腺癌细胞中,较阴性对照组显著降低。在荧光素酶检测实验中,相对于阴性对照组(CCND1 3’UTR-NC+miR-193a-3p),实验组(CCND1 3’UTR+miR-193a-3p)的荧光显著下降(P=0.006),提示miR-193a-3p与CCND1有直接结合的靶点。结论1、miR-193a-3p在胰腺导管腺癌组织及细胞中的表达水平降低;用病毒感染方法使miR-193a-3p过表达,能抑制PDAC细胞的增殖及有促进胰腺癌细胞凋亡的趋势,并且细胞周期阻滞在G1及G2/M期;2、CCND1在胰腺癌组织中表达水平升高,其与miR-193a-3p存在互补序列;并且在过表达miR-193a-3p的胰腺癌细胞中其表达水平显著下调。同时miR-193a-3p与CCND1间存在直接结合的靶向关系,提示miR-193a-3p可能是通过调控CCND1影响胰腺癌的发生发展。