目前,缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)损伤的发生发展机制尚未完全明确,现有的干预疗法仍不能有效解决I/R损伤问题。碘化N-正丁基氟哌啶醇(N-n-butyl haloperidol iodide, F2)是我课题组在氟哌啶醇(haloperidol, Hal)结构基础上改造得到的新化合物,前期研究表明,F2心肌保护作用的机制可能与其拮抗钙超载及抑制早期生长反应基因-1(early growth response-1, Egr-1) mRNA及蛋白表达相关,作为Egr-1的上游信号分子蛋白激酶C (protein kinase C, PKC),其抑制剂能够下调心肌细胞缺氧复氧(hypoxia-reoxygenation, H/R) Egr-1蛋白的高表达。PKC家族是体内广泛存在的一类可使苏/丝氨酸残基磷酸化的蛋白激酶,参与细胞内多种信号转导通路和机体功能的调控。与心肌I/R损伤紧密相关的PKC亚型有PKCα、βⅡ、δ和ε,因此,本研究观察了H/R心肌细胞PKC活性的变化；对参与调控H/R损伤的PKC亚型进行转位的分析；运用PKC特异性抑制剂或激动剂考察PKC亚型在H/R心肌细胞中的生物学功能；进一步探讨和明确F2心肌保护作用的分子机制。方法：1.采用新生SD大鼠原代培养的心肌细胞,换用高纯度氮气饱和30 min的缺氧液,置于缺氧箱中,37℃密闭培养2 h后,再用正常培养基按常规培养条件培养30 min,造成复氧损伤。2.非放射性PKC活性检测方法研究H/R心肌细胞中PKC活性的时效变化；Western-blot法检测心肌细胞PKCα、βⅡ、δ和ε蛋白表达及其转位的变化；检测H/R心肌细胞中Egr-1蛋白表达水平。3.比色法测定细胞培养上清液中肌酸激酶(creatine kinase, CK)活性、双抗体夹心光化学测定法检测细胞培养上清液中心肌肌钙蛋白(cardiac troponin I, cTnI)的浓度,以反映心肌细胞损伤的程度；酶联免疫吸附法(enzyme-linked sandwich immunoassay, ELISA)测定细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)的含量,以反映心肌细胞炎症程度；Annexin V-FITC/PI双染法检测心肌细胞早期凋亡率,以反映H/R所致心肌细胞凋亡程度。结果：1.缺氧过程中,心肌细胞PKC活性升高,缺氧2 h时PKC活性显著增加,延长缺氧时间,PKC活性趋于下降；缺氧2 h时进行复氧,PKC活性维持不变,直至复氧120 minPKC活性恢复至正常水平。缺氧2 h复氧30 min时,PKC各亚型蛋白表达未发生变化,延长缺氧时间至4 h, PKCs蛋白表达明显下降,PKCα、βⅡ和6蛋白表达不变化。心肌细胞H/R可导致CK、cTnI浓度升高,TNF-α分泌增多,早期凋亡细胞增加。2.心肌细胞H/R可激活PKC各亚型：PKCα、βⅡ和ε分别由可溶性部分向颗粒性部分转位；PKCδ则由颗粒性部分向可溶性部分转位。F2可以抑制H/R所致PKCα的转位,而激活PKCε转位；对PKCβⅡ、δ转位不影响。同时,F2可以激活正常细胞PKCε发生转位；对正常细胞PKCα、βⅡ和6不影响；磷脂酶C (phospholipase C, PLC)抑制剂U73122可拮抗F2对正常细胞和H/R PKCε激活的作用。3.cPKC特异性抑制剂Go6976,可下调Egr-1蛋白高表达,减少CK、cTnI泄漏和TNF-α的分泌,降低早期凋亡细胞检出率。PKCs亚型特异性抑制剂εV1-2,可增加CK、cTnI漏出,加快细胞早期凋亡进程,但对TNF-α的分泌和Egr-1蛋白高表达没有影响。4.F2可以明显改善H/R所致心肌细胞的损伤。PKC激动剂thymeleatoxin (TXA)可抑制F2对Egr-1蛋白高表达的下调,拮抗F2的心肌保护作用；PKCε特异性抑制剂εV1-2可拮抗F2对H/R损伤的改善作用,但对Egr-1蛋白的高表达没有影响。结论：1.心肌细胞H/R可引起PKC各亚型活性的变化,但其转位的部位及时间不一致;PKCα的转位可增加Egr-1蛋白表达。2.心肌细胞H/R过程中PKC各亚型活性的变化与H/R所致损伤有关,其中PKCα转位可加重细胞损伤与凋亡,而PKCε转位则减轻上述损伤。3.F2抑制钙依赖PKCα转位和激活非钙依赖PKCε转位可能是其抗H/R损伤的重要机制。