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机体的生理功能、生化代谢、行为改变等均表现昼夜节律现象。这种节律的紊乱可导致多种疾病,如飞行跨越不同地理时区的时差反应、昼夜轮班制作业引起的睡眠障碍、激素分泌异常诱发的代谢失调与提前衰老、特殊节律缺陷导致的神经精神疾病等。揭示昼夜节律的发生原因和调节机制,对解释正常机体的生理、生化和行为现象以及因昼夜节律紊乱而引发的病理生理过程,乃至提出相应的防治措施等都有重要的理论意义和应用价值。调控昼夜节律的生物钟包括核心钟组织视交叉上核(Suprachiasmatic nucleus,SCN)、松果体(Pineal gland,PG)和各种外周钟组织。其分子机制是在钟输入信号的作用下,若干钟基因、钟相关基因和钟控基因及其蛋白产物通过转录—翻译—翻译后事件的相互衔接,组成钟振荡器的自身调控反馈环路,实现钟信号的精确输出。至今,尽管人们对于昼夜节律生物钟振荡机制的认识有了长足的进步,但下列问题还有待于澄清:首先,在哺乳动物中,作为核心生物钟昼夜分子振荡环路中的重要钟基因—Clock,多以SCN为对象进行了相关研究,而在另一重要钟组织PG中,有关钟基因Clock和钟相关基因N-乙酰基转移酶基因(ArylalkylamineN-acetyltransferase gene,NAT,调控时间生物学信使—褪黑素分泌的关键基因)表达的昼夜节律性、二者相关性及其光反应性还不清楚。其次,PG非依赖SCN的钟振荡证据、Clock基因在SCN和PG中的昼夜转录差异及其光反应性比较,尚不详尽。另外,钟控基因的概念提出时间不长,仍缺乏具体的实验依据。外周淋巴细胞中是否存在着Clock的钟控基因,如果确定,其组织学分布和昼夜节律性表达的时间轮廓(外观)是什么,也未见报道。本研究着眼于这些问题进行探讨。目的:建立昼夜节律的动物及淋巴细胞模型:(1)探讨大鼠PG与SCN钟基因Clock和钟相关基因NAT的昼夜节律性表达及其光反应变化;(2)筛选与鉴定外周血淋巴细胞Clock的钟控基因,确定其组织学分布。旨在进一步阐明中枢昼夜节律的分子振荡基础和解析外周免疫钟运行的分子调控机制。方法:(1)在12h光照、12h黑暗交替光制[12 h-light:12 h-dark cycle,LD(12:12),4周]和持续黑暗(Constant darkness,DD,8周)光制下,分别对Sprague-Dawley大鼠造模,在一昼夜内每隔4h采集一组动物的PG和SCN组织(每组n=7),分别提取总RNA,用竞争性定量RT-PCR测定不同光制各时点下样品中Clock和NAT基因的mRNA表达水平变化,通过余弦函数和Clock Lab软件获取节律性参数,并经振幅F检验确定其昼夜节律性;(2)在LD(12 h:12 h,4周)光制下,对同一只大鼠分别在光照后2h和黑暗后2h于心脏采集外周血,分离淋巴细胞,提取总RNA,运用差异展示RT-PCR、差异cDNA片段亚克隆及测序、反向Northern杂交鉴定、实时定量PCR再验证、差异cDNA片段同源性比较和分析等技术,对外周血淋巴细胞昼夜表达差异性基因实施筛选;(3)分离、培养外周血淋巴细胞,用RNA干涉和实时定量PCR技术,鉴定所获淋巴细胞昼夜差异cDNA片段是否为Clock下游的钟控基因;(4)在LD光制下,对所鉴定的淋巴细胞钟控基因,用实时定量PCR检测其各时点昼夜节律性表达的时间变化,并测定其在不同组织中的分布和表达丰度。结果:(1)在DD或LD光制下,PG中Clock和NAT基因mRNA的表达均呈现夜高昼低的节律性振荡(振幅F检验,P＜0.05);(2)与DD光制下比较,LD光制下PG中Clock和NAT表达的节律振幅及峰值相的mRNA水平均降低(P＜0.05),而各自的节律相位无明显改变;(3)在DD或LD光制下,PG中Clock和NAT之间显示同步的节律性表达(P＞0.05);(4)于DD光制下,Clock基因在SCN和PG中的mRNA转录也展示相似的昼低夜高节律性外观(振幅F检验,P＜0.05),峰值均出现于主观夜晚[SCN为昼夜时点(circadian time,CT)15时,PG为CT18时,P＞0.05],谷值位于主观白天(SCN为CT3时,PG为CT6时,P＞0.05);(5)LD光制下SCN中Clock基因的转录也具有昼夜节律性振荡(振幅F检验,P＜0.05),但与其DD光制下节律外观相比,呈现反时相节律变化(P＜0.05),且其表达的振幅及峰值相的mRNA水平均增加(P＜0.05),而PG中Clock基因在LD光制下转录的相应节律参数变化却恰恰相反(P＜0.05);(6)在LD光制下,光照作用使PG中Clock基因转录的节律外观反时相于SCN(P＜0.05),即在SCN和PG的峰值分别出现于光照期昼夜时点(Zeitgeber time,ZT)10时和黑暗期ZT17时,谷值分别位于黑暗期ZT22时和光照期ZT5时;(7)在外周血淋巴细胞中,经筛选、鉴定了10个具有昼夜差异性表达、且受Clock调控的cDNA片段,通过RNAi实验确定其中的过氧化氢酶基因、髓鞘蛋白脂蛋白基因和组蛋白乙酰转移酶基因是Clock基因下游的钟控基因,它们在LD光制下节律性表达的峰值均出现于黑暗期,分别为ZT19、ZT19和ZT20,过氧化氢酶基因昼夜表达波动的幅度最大(P＜0.05);(8)上述三个Clock下游的钟控基因,除在外周血淋巴细胞中昼夜节律性表达外,也在心、肺、肝、肾、胸腺、松果体、视交叉上核和脑干中表达,但在不同的组织其转录水平大相径庭。结论:(1)钟基因Clock和钟相关基因NAT在PG中存在同步的内源性夜高昼低的节律表达,光照作用均使二者表达下调,但均不引起其节律相位明显移动;(2)Clock基因的昼夜转录在SCN和PG中存在着同步的内源性节律本质,而光导引在这两个中枢核团调节Clock基因昼夜节律性转录方面有着不同的作用;(3)外周血淋巴细胞中存在着Clock基因下游的若干钟控基因,其表达具有明显的昼夜节律性振荡特征,过氧化氢酶基因、髓鞘蛋白脂蛋白基因和组蛋白乙酰转移酶基因表达的节律峰值均出现于黑暗期,谷值则位于光照期;(4)这些钟控基因在不同的组织器官中有着不同的表达水平。