本实验室早期建立了日本七鳃鳗口腔腺cDNA文库,我们通过对文库中的cDNA序列和部分EST功能基因片段分析发现,日本七鳃鳗口腔腺中存在着大量中性粒细胞抑制因子(NIF)样蛋白质,将其命名为L251。接下来的结构预测和序列分析发现,L251隶属于富含半胱氨酸分泌蛋白超家族(CRISPs)、PR-1蛋白亚家族,结构上具有经典的CRISP家族的特点,即:包含有PR-1结构域、一个铰链区和一个半胱氨酸丰富结构域(CRD)。进一步的生物信息学分析发现, L251蛋白和NIF具有同样的保守序列和功能位点。由序列特异性和载体本身固有的酶切位点特异性设计引物,从cDNA文库中把L251功能基因钓取全长基因,连接到pET23b表达载体上,进一步转化至大肠肝菌BL21表达菌中,接下来通过过柱亲和层析纯化、蛋白质变性和复性得到蛋白纯品。用Transwell构建单层的HUVEC细胞分子层,对抑制中性粒细胞(neutrophil)跨内皮细胞迁移活性进行检测。实验结果表明:在fMLP诱导的中性粒细胞趋化反应中, L251在可有效的抑制中性粒细胞迁移。此外,通过将目的基因构建到pEGFP-N1载体上,采用脂质体2000的转染方法将目的基因导入HUVEC细胞内,并通过荧光显微镜和Western Blot方法分别从基因和蛋白角度检测转染情况,结果显示目的基因已转入HUVEC细胞内,并能够表达。由此构建一模拟体内内环境的单层细胞膜生物模型,进一步采用流式细胞仪检测L251蛋白抑制中性粒细胞跨膜迁移的生活学活性。实验结果显示,L251蛋白能够与中性粒细胞结合来抑制中性粒细胞的跨膜迁移。日本七鳃鳗营半寄生生活,靠其吸盘附在其它鱼体上,并由舌上的角质齿锉破鱼体,吸食其血与肉,有时被吸食之鱼最后只剩骨架却仍不能发觉七鳃鳗的存在。这是不同于以往寄生生物的具有免疫逃逸机制的新物种,其口腔腺分泌大量的L251蛋白,可能会为七鳃鳗营寄生生活逃避宿主免疫提供便利条件。L251蛋白中性粒细胞抑制因子活性的测定,将会为以后的免疫调节剂的药物开发做出巨大贡献。