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研究背景及目的:肺癌(Lung Cancer)是对人类健康和生命威胁最大的恶性癌症之一,具有较高的发病率以及死亡率,所有的肺癌患者中,约80%～90%是非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)患者。截止目前,治疗肺癌患者主要采取的是以外科手术为主的多种联合治疗,随着医疗科技水平的发展,分子药物精准靶向治疗越来越成为现在治疗肺癌的首选,为NSCLC患者早期治疗提供了新的途径。但绝大多数肺癌患者的预后仍然很差,据数据统计,其5年生存率只有1 5%左右。而超过90%的肺癌患者由于肺癌细胞的不断转移造成快速死亡。肺癌细胞发生转移过程中,上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)发挥了重要的作用,EMT的发生与多种细胞因子、转录因子和信号传导通路等有关,其中转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β参与介导的EMT在NSCLC的转移、侵袭过程中扮演着重要的作用。最近几年在表观遗传研究领域发现RNA水平m6A(N6-methyladenine,m6A)去甲基化酶 ALKBH5(alk B homolog 5,ALKBH5)参与到了许多种癌症发生过程的修饰中,然而其在肺癌尤其是非小细胞肺癌中的作用以及内在分子机制的研究阐述的甚少,本论文主要在NSCLC细胞株中,从TGF-β/Smad介导的EMT信号通路入手,去探索ALKBH5发挥的作用以及发生这种作用的分子机制。研究方法:(1)利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测97对NSCLC临床样本中ALKBH5、SMAD3、SMAD7 和 TGFβR2 mRNA 的表达水平,进一步分析 ALKBH5与SMAD3、SMAD7及TGFβR2在mRNA表达水平的相关性。(2)A549和SPC-A1细胞经TGF-β1处理预定时间后,用Real-time PCR和Western Blotting检测ALKBH5 mRNA和蛋白的表达水平。(3)构建、筛选稳定过表达ALKBH5的A549稳转细胞株,Real-time PCR和western blot检测ALKBH5的过表达效率。TGF-β1处理24h诱导A549稳胞株发生EMT,进一步检测过表达ALKBH5对TGF-β1处理下EMT标志蛋白表达水平的影响。(4)在A549细胞和SPC-A1细胞中瞬时转染靶向ALKBH5的siRNAs(si-ALKBH5-1 和 si-ALKBH5-2),Real-time PCR 和 Western Blotting 检测 ALKBH5的敲降效果。TGF-β1处理24h诱导NSCLC细胞发生EMT,进一步检测干扰ALKBH5对TGF-β1处理下EMT标志蛋白表达水平的影响。(5)利用Transwell迁移和侵袭实验检测过表达或敲降ALKBH5对TGF-β1诱导的NSCLC细胞迁移和侵袭能力的影响。(6)建立裸鼠肺癌转移模型,检测过表达ALKBH5对A549细胞体内转移能力的影响。(7)采用 Real-time PCR 和 Western Blotting 方法分析过表达 ALKBH5 对TGF-β/Smad信号通路关键因子(如TGFBR1、TGFBR2和Smads)mRNA和蛋白表达水平的影响。(8)RNA 结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)技术检测过表达ALKBH5对TGF-β/Smad信号通路关键基因(如TGFBR1、TGFBR2和Smads)m6A修饰水平的影响。(9)利用siRNAs分别敲降m6A识别蛋白YTHDF1-3家族(YTH Domain Family Protein 1-3),Real-time PCR 检测 YTHDF1-3 的敲降效果。进一步检测敲降YTHDF1-3是否影响ALKBH5对TGF-β/Smad信号通路关键基因mRNA水平的调控作用。研究结果:(1)97对NSCLC临床样本检测发现,与癌旁组织相比,癌组织中ALKBH5的mRNA表达水平显著下调(p<0.001);相比非转移组(未出现淋巴结转移及远端转移),转移组中ALKBH5、SMAD3和TGFβR2的mRNA(T/N)水平显著上调(p<0.05),而SMAD7的mRNA(T/N)水平显著下调(p<0.001)。进一步分析发现,ALKBH5与SMAD3和TGFβR2的mRNA水平呈正相关(p<0.05),而与SMAD7的mRNA表达水平呈负相关(p<0.05)。(2)TGF-β1 分别处理NSCLC 细胞 0、2、4、8、12 及 24h 后,ALKBH5 mRNA和蛋白的表达水平随TGF-β1处理时间的延长呈逐步下调趋势。(3)成功构建、筛选出ALKBH5过表达的NSCLC稳转细胞株。TGF-β1刺激24h可诱导A549和SPC-A1稳转细胞株发生EMT,过表达ALKBH5显著促进TGF-β1刺激下上皮标志分子的表达,而显著抑制TGF-β1刺激下间质标志分子的表达。(4)si-ALKBH5-1/2能够有效敲降ALKBH5的表达。TGF-β1刺激24h可诱导A549和SPC-A1瞬时敲降细胞株发生EMT,敲弱ALKBH5显著抑制TGF-β1刺激下上皮标志分子的表达,而显著促进TGF-β1刺激下间质标志分子的表达。(5)过表达ALKBH5显著抑制TGF-β1诱导的NSCLC细胞的迁移与侵袭能力,而敲弱ALKBH5显著促进TGF-β1诱导的NSCLC细胞的迁移与侵袭能力。(6)在裸鼠肺转移模型中,过表达ALKBH5显著抑制A549细胞体内转移能力。(7)过表达ALKBH5抑制TGFβ/Smad通路正向调控因子SMAD3和TGFβR2的mRNA及蛋白水平,而促进TGFβ/Smad通路负向调控因子SMAD7的mRNA和蛋白水平。(8)过表达ALKBH5广泛抑制TGF-β/Smad信号通路中关键基因SMAD3、SMAD7 和 TGFβR2 的 m6A 水平。(9)m6A识别蛋白YTHDF1和3在ALKBH5负向调控SMAD3和TGFβR2的表达中发挥作用,而YTHDF2在ALKBH5促进SMAD7的表达中发挥关键作用。研究结论:本研究初步证实,ALKBH5抑制TGF-β1诱导NSCLC的EMT和转移,其可能的机制是ALKBH5精准抑制TGF-β/Smad信号通路关键因子TGFβR2、SMAD3和SMAD7的m6A水平,进而通过m6A识别酶YTHDF1和YTHDF3负向调控SMAD3和TGFβR2的表达以及通过YTHDF2正向调控SMAD7的表达而协同发挥抑癌功能。本研究为通过ALKBH5介导的m6A修饰调控TGF-β/Smad信号通路而抑制NSCLC的转移提供新的理论基础。