大疱性类天疱疮(BP)是皮肤科常见的自身免疫性水疱性皮肤病,主要累及中老年人,慢性病程、病情顽固、易反复发作,严重影响患者身心健康。BP临床以顽固性水疱大疱为主要特点,组织病理主要表现为表皮下水疱及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的局部浸润,免疫病理则可见基底膜带IgG抗体和补体C3的线状沉积。因发病机制尚不明确,目前BP的治疗主要依靠系统应用糖皮质激素和免疫抑制剂控制病情、减少复发,但在疗效、药物不良反应等方面尚存在较多问题。因此,深入研究BP发病机制,探索更为有效、更具针对性的治疗方法显得尤为重要。目前学者普遍认为,BP的发病是特异性自身抗体与抗原结合,引起包括补体活化、肥大细胞脱颗粒、趋化中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等炎细胞浸润以及蛋白水解酶的释放等在内的一系列免疫炎性反应,破坏真表皮间的连接,引起表皮下水疱的发生。研究发现,大疱性类天疱疮抗原2(BPAG2)是BP的主要自身抗原,是位于皮肤基底膜带的一种跨膜蛋白,其胞外域第16个非胶原编码区(NC16A)是自身反应性T细胞识别的主要区域,也是自身抗体结合的主要区域,但自身反应性T细胞和自身抗体作用的具体抗原表位尚不明确。进一步明确BP抗原表位,并进行抗原表位的HLA限制性分析,对于深入研究BP的发病机制、探索更具针对性的新的治疗手段具有重要意义。目的:鉴定bp抗原bpag2分子的t细胞表位,分析t细胞表位的hla限制性,研究基于表位的抗体产生机制及免疫应答过程,探索bp特异性治疗手段。方法:(1)表位作图法合成重叠肽:以包含bpag2-nc16a片段全长的77个氨基酸(490-566aa)为筛选靶区域,自n端向c端依次重叠12个氨基酸,合成22条重叠肽(15肽),直至覆盖bpag2-nc16a全长。(2)th1细胞表位的筛查:采用elispot方法,检测合成的22条重叠肽刺激bp患者pbmc后分泌细胞因子ifn-γ的情况,筛选bp患者的th1细胞表位。(3)th2细胞表位的筛查:采用elispot方法,检测合成的22条重叠肽刺激bp患者pbmc后分泌细胞因子il-4的情况,筛选bp患者的th2细胞表位。(4)t细胞表位对cd4+t细胞增殖的影响:分离肽段反应阳性的bp患者pbmc,经cfse染色后用筛选出的t细胞阳性肽段刺激并培养7天,通过流式细胞术检测cd4+t细胞的增殖情况。(5)t细胞表位对b细胞活化的影响:用筛选出的t细胞阳性肽段,同上分别刺激bp患者及健康对照者pbmc,培养7天后用elisa方法检测培养上清中可溶性cd23水平来反映b细胞活化情况。(6)t细胞表位对抗体产生的影响:用筛选出的t细胞阳性肽段,同上刺激bp患者及健康对照者pbmc,培养7天后用elisa检测培养上清中抗bpag2-nc16a抗体产生情况。(7)t细胞表位扩展现象研究:分别抽取同一bp患者疾病活动期及疾病稳定期外周血,提取pbmc,用同样的elispot方法检测bp患者不同病期t细胞表位变化情况,分析其表位扩展现象。(8)t细胞表位的hla限制性分析:分离肽段反应阳性的bp患者pbmc,分别预先加入hla-abc、hla-dp、hla-dq、hla-dr中和抗体,然后用筛选出的阳性肽段进行刺激,根据刺激后的反应情况明确其hla限制性。结果:(1)22条重叠肽刺激25例活动期bp患者pbmc后,21号肽段致使8例患者(占全部患者的32%)、18号肽段致使9例患者(占全部患者的36%)、14号肽段和13号肽段均致使10例患者(占全部患者的40%)分泌较多的细胞因子ifn-γ,产生较为强烈的th1细胞应答。说明bpag2-nc16a重叠肽中的21号肽段492-506aa:vrklkarvdelerir、18号肽段501-515aa:elerirrsilpygds、14号肽段513-527aa:gdsmdriekdrlqgm和13号肽段516-530aa:mdriekdrlqgmapa为潜在的bp特异性th1细胞表位。(2)22条重叠肽刺激26例活动期bp患者pbmc后,21号肽段致使15例患者(占全部患者的57.7%)、20号肽段致使9例患者(占全部患者的34.6%)、18号肽段和14号肽段均致使7例患者(占全部患者的26.9%)分泌较多的细胞因子il-4,产生较为强烈的th2细胞应答。说明bpag2-nc16a重叠肽中的21号肽段492-506aa:vrklkarvdelerir、20号肽段495-509aa:lkarvdelerirrsi、18号肽段501-515aa:elerirrsilpygds和14号肽段513-527aa:gdsmdriekdrlqgm为潜在的bp特异性th2细胞表位。(3)22条重叠肽刺激ifn-γ分泌的th1细胞表位应答宽度和刺激il-4分泌的th2细胞表位应答宽度与患者抗bpag2-nc16a抗体滴度均不相关。(4)以上筛选获得的th2表位阳性患者,其pbmc经21号肽段、20号肽段和14号肽段刺激后,分泌il-4的水平明显升高并与患者抗bpag2-nc16a抗体滴度呈正相关。(5)筛选出的阳性肽段21号、18号和14号,刺激bp患者pbmc后,cd4+t细胞表现出明显的增殖,与阴性对照及空白对照相比具有差异。(6)筛选出的阳性肽段21号、18号和14号,刺激bp患者pbmc后,与健康对照组相比,bp患者组b细胞活化水平升高。(7)筛选出的阳性肽段21号、18号和14号,刺激bp患者pbmc后,细胞培养上清中可检测出抗bpag2-nc16a抗体。(8)采用相同的方法对bp患者不同时期的th2表位进行鉴定,发现患者疾病稳定期阳性肽段数均少于活动期阳性肽段数,但疾病稳定期与疾病活动期阳性肽段并不完全一致,部分患者有新的表位出现,说明存在表位扩展现象。(9)对t细胞表位进行hla限制性分析发现,预先加入hla-abc和hla-dr中和抗体可使阳性肽段刺激bp患者pbmc后il-4分泌明显减少,而预先加入hla-dp中和抗体和hla-dq中和抗体并不能减少刺激后的il-4分泌,说明筛选出的阳性肽段是属于HLA-ABC和HLA-DR限制性的。结论:BP患者自身抗原BPAG2分子的NC16A区域具有明确的Th1细胞表位和Th2细胞表位。Th2细胞表位刺激细胞应答的强度与BP患者血清自身抗体的滴度呈正相关。阳性表位刺激BP患者PBMC可以促进CD4+T细胞的增殖、促进B细胞的活化以及BP特异性抗体的产生。BP患者在不同的病期其Th2表位有所差异,存在表位扩展现象。经分析发现,筛选出的阳性表位均属于HLA-ABC及HLA-DR限制型。我们的研究揭示了与BP发病相关的T细胞表位,首次明确了T细胞表位与致病性自身抗体产生的相关性,加深了对BP发病机制特别是致病性自身抗体产生机制的认识,并为探索更具针对性的治疗手段提供了新的思路。