目的:根据全球及我国癌症中心数据,无论在全球还是中国,结直肠癌的发病率及死亡率均位居前五位,结直肠癌无论在发病率还是死亡率上都不容小觑。肿瘤细胞的侵袭、转移是恶性肿瘤的主要特征,结直肠癌肝、肺等转移在临床极为常见,也是导致患者死亡的主要原因。研究结直肠癌转移机制,发现调控结直肠癌转移的关键靶分子,对预防和治疗结直肠癌肝转移有重要意义。丝状伪足是细胞对外界环境的感受器,多项研究表明,丝状伪足在恶性肿瘤转移的起始阶段、中间阶段,及远处靶器官定居的终末阶段均发挥关键作用。肌球蛋白X(Myosin X,Myo 10)是我们前期研究中发现的、一种定位在丝状伪足尖端的非传统肌球蛋白,可通过促进丝状伪足的生长,来增强肿瘤细胞的迁移能力及侵袭力。本研究运用CRISPR/Cas9技术敲除Myo10,通过细胞学实验、动物皮下成瘤及肝转移模型及等相关实验,以观察其对结直肠癌细胞系增殖、迁移的影响及其可能机制。以期发现Myosin X在结直肠癌形成、侵袭转移中的作用及其临床意义。方法:1、分别根据NCBI里查询获得的人源和鼠源Myo10基因序列设计CRISPR/Cas9敲除的sg RNA序列,将sg RNA序列与含Cas9蛋白的载体lenti-CRISPR v2连接,将连接成功的载体利用293T细胞制作慢病毒侵染HCT116、SW620和CT26结直肠癌细胞系,经有限稀释法后进行单克隆筛选,利用Western blotting方法验证单克隆细胞株Myo10蛋白的表达情况并建立稳定细胞系。2、利用已成功建立的HCT116 Myo10敲除及对照稳定细胞系,CCK8细胞增殖实验比较Myo10敲除前后细胞增殖活力变化;流式细胞仪检测细胞周期变化;rhodamine phalloidin染色比较敲除前后F-actin变化;采用划痕实验,Transwell检测迁移率比较两者迁移能力变化;进行Myo X调控结直肠癌细胞相关生物学行为的实验。3、对Myo10敲除及对照稳定细胞系进行RNAi sequenceq分析,并通过实时PCR实验验证Myo10敲除前后不同目标蛋白m RNA水平的变化,寻找Myo 10参与结直肠癌增殖、侵袭、转移的机制。4、接种HCT116-NC细胞和HCT116-KO细胞以2×106个/只分别接种到Balb/cnu裸鼠右后肢外侧皮下(n=5)构建裸鼠皮下移植瘤模型;及通过脾脏注射肿瘤细胞的方案建立小鼠肝转移模型,2周后将小鼠行MRI活体成像观察有无肿瘤形成,比较两组移植瘤形成能力的差异。结果:1、根据引物设计网站共设计5对人源sg RNA和5对鼠源sg RNA序列,测序显示均成功连接至lenti-CRISPR v2载体,经Western Blot检测得到Myo10成功敲除的结直肠癌人源细胞系2种,鼠源细胞系1种;2、敲除Myo10后HCT116细胞形态发生改变,rhodamine phalloidin染色发现HCT116细胞形态由梭形大部分变为圆形,F-actin的数量减少;细胞增殖速率减慢,CCK-8结果显示HCT116-KO细胞增殖活力下降;流式细胞术发现敲除Myo10后细胞周期发生改变,与细胞周期相关蛋白发生相应变化。3、敲除Myo10后HCT116细胞迁移能力发生改变,细胞划痕实验、Transwell迁移实验显示敲除Myo10后细胞迁移能力下降;q PCR结果显示一部分与细胞侵袭转移相关基因m RNA水平发生变化,HCT116-KO组LRFN4、CAPN2、CD44、RAC1、CDC42的m RNA水平均下降。4、成功构建了HCT116细胞裸鼠皮下移植瘤模型,细胞接种5天后,在细胞注射部位有类似包块状突起形成,HCT116-NC组形成的肿瘤体积为114.66±54.50mm3,HCT116-KO组形成的肿瘤体积为73.25±38.84 mm3。之后隔天测量,12天后处死裸鼠,HCT116-NC组形成的肿瘤体积为5492.47±1781.23mm3,HCT116-KO组形成的肿瘤体积为1794.87±786.27mm3,经One-way ANONA统计分析差异具有显著性,敲除Myo10后其肿瘤生长速率降低;5、通过脾脏注射肿瘤细胞的方案成功建立小鼠肝转移模型,2周的腹部MRI活体检查显示在对照组中6只小鼠中均发生脾脏种植及脾内转移,其中4只出现肝转移。而Myo10敲除组6只小鼠中1只出现脾内成瘤,另5只未见脾成瘤,6只均未发生肝转移。对肝组织进行HE染色,镜检证实对照组肝转移部位为肿瘤细胞。结论:体内及体外实验均表明Myo10参与结直肠癌的增殖、侵袭、转移,Myo10的敲除显著降低了HCT116细胞增殖活力、细胞迁移能力。其机制可能与细胞周期蛋白CDK6、CDK2、CCND1的表达水平降低有关。Myo10的敲除可能通过影响细胞有丝分裂、降低与侵袭迁移相关基因表达水平等途径降低结直肠癌增殖和侵袭迁移能力。