[背景]众所周知，糖尿病是由于胰岛素分泌和（或）作用缺陷所引起的一组以慢性血葡萄糖水平增高为特征的代谢性疾病，是学术界一直难以攻克的难题。近年来研究提示，胰岛β细胞功能减退和数量减少在糖尿病的发病和病程进展中都具有重要的作用。如何保护胰岛β细胞的功能，增加胰岛β细胞数量，已成为2型糖尿病研究中的热点。胰高糖素样多肽1（Glucagon-like peptide1，GLP-1）能根据体内葡萄糖水平的高低，按需促进胰岛素分泌，调节血糖，近年来获得较多关注。利拉鲁肽是GLP-1长效类似物，克服了天然GLP-1易被降解的特点，同时发挥GLP-1的多效作用，包括降糖、β细胞保护、减重、降压、调脂全面干预多种糖尿病危险因素，且较少发生低血糖风险，安全性好，在治疗2型糖尿病及防治心血管风险方面具有独特优势，但是其保护胰岛β细胞的机制尚不十分明确。研究表明胰岛β细胞置于棕榈酸环境中可以激活内质网应激反应通路，导致β细胞功能异常改变，机体通过自噬来应对内质网应激，同时文献研究中证实自噬（Autophagy）与胰岛β细胞关系密切，在各个生理调节中发挥着重要的作用。自噬不但可以保护胰岛β细胞免受外来因素所诱导的凋亡，还可以维持胰岛β细胞结构、数量、功能，同时自噬还可以维持内环境的稳态[1-3]。因此，我们推测利拉鲁肽保护胰岛β细胞的机制可能与自噬的激活相关。[目的]基于上述理论，本研究以体内外实验相结合，阐明自噬在利拉鲁肽保护胰岛β细胞中的作用及机制。从一个新的角度阐明了利拉鲁肽保护胰岛β细胞的机制，为临床防治胰岛β细胞凋亡提供实验基础。[方法]1、自噬在利拉鲁肽保护胰岛β细胞中的作用及机制研究利拉鲁肽对高脂作用下胰岛β细胞保护作用的研究：应用MTT法检测利拉鲁肽对高脂作用下胰岛细胞瘤系胰岛细胞（INS-1细胞）死亡的影响，以及AnnexinV/PI双染法检测INS-1细胞的凋亡情况；利拉鲁肽激活胰岛β细胞自噬的研究：应用GFP-LC3转染INS-1细胞，荧光显微镜下观察荧光点状分布情况，Westernblot检测蛋白LC3B和自噬相关基因ATG7、Beclin1、p62、ATG5表达的情况，并用RT-PCR法检测相应的基因表达，以及电镜下观察自噬小体形成等方式观察利拉鲁肽对INS-1细胞自噬激活的影响；利拉鲁肽激活胰岛β细胞自噬的机制研究：通过Westernblot检测利拉鲁肽作用下内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP、JNK，并用RT-PCR法检测相应的基因表达；抑制自噬对利拉鲁肽保护作用的影响：自噬抑制剂（氯喹、3-MA）预先作用INS-1细胞，应用MTT法检测利拉鲁肽+自噬抑制剂对高脂作用下INS-1细胞死亡的影响，以及AnnexinV/PI双染法检测INS-1细胞的凋亡情况。2、自噬在利拉鲁肽保护高脂喂养ApoE^-/-小鼠中的作用健康SPF级6周龄ApoE^-/-雄性小鼠40只，随机分为普通维持饲料喂养组（A:N组）、高脂饲料喂养组（B:HF组）、高脂饲料+利拉鲁肽处理组（C:HF+L组）、高脂饲料+利拉鲁肽+氯喹处理组（D:HF+L+CQ组），每组10只，高脂喂养12周，药物处理4周，每2周称取体重、摄食量、摄水量。生化方法测定血清葡萄糖（FBG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），放射免疫法测定游离脂肪酸（FFA）。心脏、肝脏、肾脏、下丘脑、胰脏、脂肪HE染色，光镜下观察各器官形态学变化。电镜下观察自噬小体形成。用免疫组化的方法检测胰腺和下丘脑中GRP78、CHOP、JNK3、LC3B的表达。3、自噬在利拉鲁肽保护高脂喂养ApoE^-/-小鼠糖尿病模型中的作用健康SPF级6周龄ApoE^-/-雄性小鼠36只，随机分为普通维持饲料喂养组（A:N组）、高脂饲料喂养组（B:HF组）、高脂饲料+利拉鲁肽处理组（C:HF+L组）、高脂饲料+利拉鲁肽+氯喹处理组（D:HF+L+CQ组），每组9只，高脂喂养8周后，予链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）一次性腹腔造模。成功后药物处理30天，每2周称取体重、摄食量、摄水量。生化方法测定血清葡萄糖（FBG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），放射免疫法测定血清胰岛素（INS）、游离脂肪酸（FFA）。肝脏、肾脏、心脏、胰脏HE染色，光镜下观察各器官形态学变化。电镜下观察自噬小体形成。用免疫组化的方法检测胰腺和下丘脑中GRP78、CHOP、JNK3、LC3B的表达。用Westernblot方法检测胰腺组织GRP78、CHOP蛋白表达。[结果]1、自噬在利拉鲁肽保护胰岛β细胞中的作用及机制研究利拉鲁肽+高脂组较高脂组INS-1细胞生存率增加（P＜0.05），凋亡减少；利拉鲁肽处理的INS-1细胞，LC3B和p62的表达升高，ATG7、Beclin1表达降低，RT-PCR结果显示基因表达p62升高，ATG7、Beclin1降低，电镜下自噬小体的形成也明显增加，质粒转染后其成点状绿色荧光的数量明显增多；利拉鲁肽激活自噬的机制，是通过应答内质网应激来实现的。主要是利拉鲁肽处理后，内质网应激通路开关GRP-78、CHOP表达降低。氯喹和3-MA应用后，在利拉鲁肽存在的情况下，利拉鲁肽+氯喹+游离脂肪酸组和利拉鲁肽+3-MA+游离脂肪酸组作用下INS-1细胞凋亡情况明显高于利拉鲁肽+游离脂肪酸组。利拉鲁肽+氯喹+游离脂肪酸作用组和利拉鲁肽+3-MA+游离脂肪酸组细胞死亡明显增多（P＜0.05）。2、自噬在利拉鲁肽保护高脂喂养ApoE^-/-小鼠中的作用小鼠喂养12周后，与普食组相比，高脂组ApoE^-/-小鼠FFA、LDL-C水平高于普通饮食组（P＜0.05），而体重、TC、TG、FBG与普食组相比，无统计学意义（P＞0.05）。药物干预4周后，与高脂组相比，利拉鲁肽处理组ApoE^-/-小鼠FBG、TC、TG、LDL、FFA都有不同程度下降，其中LDL-C、FFA显著下降（P＜0.05），FBG、TC、TG降低无统计学意义（P＞0.05）。而HF+L+CQ组与高脂组各项指标差别均无统计学意义（P＞0.05）。在光镜下观察C组小鼠心脏泡沫细胞聚集减少，肝脏、肾脏脂肪沉积减轻，脂肪细胞体积减小。免疫组化胰腺C组小鼠LC3B强阳性表达，下丘脑C组小鼠在利拉鲁肽处理后JNK3，CHOP表达下降。电镜下，C组可见多个自噬小体。3、自噬在利拉鲁肽保护高脂喂养ApoE^-/-小鼠糖尿病模型中的作用小鼠喂养8周后，以链脲佐菌素（STZ）成功造模，高脂组ApoE^-/-小鼠FBG、TC、LDL-C水平高于普通饮食组（P＜0.05），体重、TG、FFA、INS等指标变化无统计学意义（P＞0.05）。药物处理30天后发现，与高脂组相比，利拉鲁肽处理组ApoE^-/-小鼠FBG、TC、TG、LDL、FFA都有不同程度下降，其中FBG、TC、INS、TG、LDL-C均降低（P＜0.05），FFA变化无统计学意义。而HF+L+CQ组与高脂组各项指标差别均无统计学意义（P＞0.05）。在光镜下，在高脂饮食和高糖环境的刺激下，ApoE^-/-小鼠出现明显代谢性变化，包括形成较大面积的动脉斑块，肝脏脂滴弥漫性浸润、大量炎细胞浸润，肾小球炎症增生，脂肪细胞体积增大。在经过利拉鲁肽治疗后，小鼠各个器官代谢症状明显改善而同时注射自噬抑制剂的小鼠，症状改善不明显。免疫组化C组小鼠下丘脑JNK3（—），LC3（++）。电镜下，C组小鼠可见自噬小体形成。Westernblot检测胰腺组织蛋白表达，可见C组GRP78、CHOP蛋白表达较B组减少。[结论]经过体外细胞高脂培养、体内高脂环境和体内糖尿病环境的作用，证实经利拉鲁肽处理后，均可产生自噬保护胰岛β细胞，而抑制自噬后，利拉鲁肽保护作用减弱或消失。在体外细胞培养中，自噬在利拉鲁肽对胰岛细胞的保护作用中起到关键作用，自噬的激活是通过应答内质网应激。在体内环境中，利拉鲁肽治疗高脂和高糖ApoE^-/-小鼠，能够有效改善机体代谢紊乱，降低血糖和血脂水平，减轻各重要脏器脂肪沉积，使机体内坏境回归稳态。本课题从一个新的角度阐明了利拉鲁肽保护胰岛β细胞的机制，也为临床防治胰岛β细胞凋亡提供实验基础。