ABRO1,也被称为KIAA0157或者FAM175B,属FAM175家族,是ABRA1的兄弟蛋白,所以又称为ABRO1。目前关于它的功能了解很少。最近的一项研究表明ABRO1参与BRISC复合体(BRCC36-containingisopeptidasecomplex)的形成。BRISC复合体由BRCC36、BRE、NBA1和ABRO1等蛋白组成,特异性剪切K63链接的多聚泛素链。ABRO1作为一个中央支架蛋白质组装并促进BRISC复合体的去泛素化酶催化作用。最近,ABRO1被报道与控制G2/M期和细胞凋亡的锌指转录因子THAP5相互作用。在心肌细胞中,增加ABRO1表达显著降低靶蛋白特异性K63链接的泛素化并减少细胞损伤和细胞死亡,对于冠状动脉疾病(CAD)患者的心肌梗塞和心肌保护有重要作用。此外,前期去泛素化酶以及与之相关的蛋白复合体的蛋白质组学分析表明USP7可能结合ABRO1。有关ABRO1与p53功能相关还未见报道。实验室前期工作表明ABRO1在多种肿瘤组织中表达显著下调,我们结合实验室前期工作,对ABRO1的生物学功能和机制进行了深入研究。　　在本项研究中,我们首先通过构建过表达和敲低ABRO1的HCT116p53+/+和HCT116p53-/-稳定细胞株,用细胞克隆形成实验证明了过表达ABRO1能明显抑制HCT116p53+/+细胞克隆形成,而对HCT116p53-/-细胞克隆数没有影响;敲低ABRO1促进HCT116p53+/+细胞克隆形成,而不影响116p53-/-细胞克隆数。进而我们用流式细胞仪分析发现过表达ABRO1能诱导HCT116p53+/+细胞G0/G1期细胞周期阻滞。裸鼠荷瘤实验也证明了ABRO1能抑制细胞增殖,并具有p53依赖性。我们用Co-IP和GST-pulldown实验证明了ABRO1和p53存在着直接生理性相互作用,并确定了相互作用结构域。Westernblot实验表明过表达ABRO1能明显延长p53蛋白质的半衰期,敲低ABRO1显著缩短其半衰期。过表达ABRO1能抑制MDM2介导的p53出核,减少p53泛素化降解,而敲低ABRO1则促进ABRO1出核,增加p53泛素化降解。我们用Co-IP和GST-pulldown实验证明了ABRO1和USP7存在直接相互作用,并且USP7、p53和ABRO1三者的相互作用位点不重叠,形成稳定的蛋白质复合体。我们用Co-IP实验证明了过表达ABRO1增强USP7结合p53的能力,增强USP7去p53泛素化;敲低ABRO1减弱p53和USP7的相互作用,增加p53多聚泛素化降解。同时,我们发现USP7不影响ABRO1结合p53,Co-IP实验表明敲低USP7后ABRO1和p53相互作用没有变化。体内泛素化实验表明敲低USP7能明显降低ABRO1对p53的去泛素化能力,敲低ABRO1也明显降低USP7对p53的去泛素化能力。　　MDM2是p53主要的E3泛素链接酶,介导p53的泛素化降解。MDM2和p53能同时相互独立的结合去泛素化酶USP7,USP7能剪切二者的多聚泛素链,并且USP7对MDM2的亲和力要高于p53,MDM2是USP7优先的底物蛋白。我们首先在HCT116p53-/-细胞中过表达ABRO1,发现MDM2蛋白水平没有显著变化。进而我们在HCT116p53-/-细胞中过表达ABRO1,用CHX处理细胞,发现MDM2的半衰期未发生明显变化;敲低ABRO1后,MDM2的半衰期也没有明显改变。Co-IP实验表明,在p53缺失的H1299细胞中MDM2和ABRO1不存在生理性相互作用。我们分别用RNAi技术敲低BRISC复合体中的NBA1、BRCC36和BRE后,发现BRCC36不影响p53蛋白稳定性,而BRE和NBA1则能稳定p53蛋白。但是,westernblot实验表明敲低BRE同时过表达ABRO1仍然可以上调p53蛋白水平。我们用Co-IP实验证明了USP7/p53/ABRO1复合体与BRISC复合体不结合在一起。　　DOX能诱导DNA损伤应激反应,我们用DOX刺激HCT116p53+/+细胞,模拟DNA损伤,结果发现ABRO1蛋白表达随着DOX刺激的时间延长而增加,同时p53表达也随着增加;敲低ABRO1后,DOX则不能诱导p53和p21表达上调。进一步我们转染GFP-ABRO1入MCF7细胞,GFP-ABRO1大部分定位于细胞质中,用DOX刺激后发现GFP-ABRO1大部分转位入核。DNA损伤能诱导HCT116p53+/+细胞凋亡增多,诱导G0/G1期细胞周期阻滞。我们用DOX刺激HCT116p53+/+细胞诱导DNA损伤,同时用RNAi技术敲低ABRO1,用流式细胞仪检测细胞凋亡数,发现敲低ABRO1导致细胞凋亡明显减少,而在HCT116p53-/-细胞中却无此现象;同时,敲低ABRO1导致G0/G1期细胞数明显减少,而对HCT116p53-/-细胞周期无明显影响。　　前期实验室工作表明了ABRO1在多种肿瘤组织中表达显著下调,尤其是在肝癌组织中更为明显。因此,我们用肝癌组织芯片检测了157例样本中ABRO1的表达情况,统计学分析结果表明ABRO1在肝癌组织中表达明显低于其相应癌旁组织,并且ABRO1和p53在肝癌组织中表达呈显著性正相关,而在癌旁组织中没有相关性。进一步我们还发现ABRO1阳性的病人手术后存活时间比ABRO1阴性的病人要长。　　我们的结果发现ABRO1以p53依赖方式抑制细胞增殖,并证实ABRO1可与USP7,p53形成蛋白质复合体,促进USP7和p53的相互作用,去泛素化p53,结果是增加p53稳定性和转录活性,致G0/G1期细胞周期阻滞。在非应激条件下,ABRO1主要定位于细胞质。DNA损伤时,ABRO1表达增加,并转位入核参与p53的活化。我们的实验还证明ABRO1调控p53活性不依赖于BRISC复合体活性及对MDM2稳定性的调控。在肝癌组织中ABRO1表达下调,其表达水平与肝癌组织中p53表达水平及患者预后密切关联。这揭示了肿瘤细胞中p53下调表达的新的分子机制,提示ABRO1可能是一个新型肿瘤抑制因子和肝癌预后检测指标。综上,我们的结果揭示ABRO1是一个新的p53调节分子,在调节细胞增殖和DNA损伤应急反应中起重要作用。　　我们推测在非应激情况下ABRO1呈持续较低水平表达,并主要分布于细胞质,这有利于USP7靶向MDM2,使细胞维持p53的低水平表达。当基因毒应激时,一方面通过ATM依赖的磷酸化修饰,USP7与MDM2/MDMX结合的亲和力变弱,另一方面,ABRO1的表达被DNA损伤迅速诱导上调并转位入核,促使USP7靶向p53,拮抗MDM2对p53的泛素化修饰,从而快速诱导p53的稳定和活化。目前,我们还不清楚是何种机制参与DNA损伤时ABRO1的表达上调,以及是否有翻译后修饰控制了ABRO1的核转位。