主要组织相容性复合体(Major Histocompitibility Complex,MHC)是由一组高度多态性基因组成的染色体区域,其编码产物广泛参与免疫应答的诱导和调节,激发机体特异性免疫反应,在免疫学上具有极为重要的意义。鱼类的MHC II类基因产物的主要功能是结合经加工处理的外源性抗原肽并呈递给CD4+ T细胞,协助B细胞的增殖和细胞因子的分泌,对外来病原体的免疫具有非常特殊的意义。本实验以鲤鱼(Cyprinus carpio L.)为研究材料,Trizol法提取鲤鱼脾脏总RNA,RT-PCR方法扩增得到编码MHC IIβ链的部分cDNA序列,对该序列进行结构和系统进化分析;分别提取鲤鱼肝脏、脾脏、头肾、前肠、后肠、口腔上皮、鳃、皮肤、肌肉、性腺和血液组织总RNA,检测MHC IIβmRNA在各组织中的分布情况。采用Real-time PCR检测了鳗弧菌浸泡刺激不同时间脾脏、头肾、前肠和后肠中MHC IIβmRNA水平的变化。将编码MHC IIβ链β1、β2结构域的cDNA片段,分别克隆到质粒pET-28a(+)和pcDNA3.1(+)中,构建原核表达载体pET-28a(+)/MHC II B和真核表达载体pcDNA3.1(+)/MHC II B;将pET-28a(+)/MHC II B转化大肠杆菌DE3 (BL21),并经IPTG诱导融合蛋白的表达,将大量表达并纯化的包涵体蛋白免疫新西兰雄兔得到多克隆抗血清;将pcDNA3.1(+)/MHC II B注射小鼠进行基因免疫,制备鼠多克隆抗血清;蛋白质印迹分析检测抗血清特异性,免疫琼脂双向扩散测定抗血清的效价。取正常鲤鱼前肠、后肠,制备石蜡切片,HE染色显示其结构,免疫组化研究MHC IIβ分子在鲤鱼肠组织中的分布。实验结果如下:本文克隆得到的编码鲤鱼MHC IIβ分子胞外区的cDNA片段长610 bp,包括部分前导肽、β1结构域、β2结构域和部分连接肽,编码202个氨基酸,与已报道的Cyca-DAB*02编码的氨基酸序列相似性为89.1%,核苷酸差异主要存在于β1结构域,即与外源肽相互作用的部位。对多种鱼类和部分哺乳动物的MHC IIβ氨基酸序列比对表明,各种硬骨鱼之间的序列相似性较高,而硬骨鱼与鲨鱼和哺乳类之间的差异则较大;各物种β2结构域之间的相似性高于β1结构域,且含有较多的保守氨基酸残基;系统进化分析表明,硬骨鱼与哺乳动物和鲨鱼处于不同的分支上,在硬骨鱼中,鲤鱼与斑马鱼处于同一分支,亲缘关系最近。RT-PCR结果表明,MHC IIβmRNA在正常鲤鱼脾脏、头肾、前肠、后肠、口腔上皮、皮肤、鳃、全血和性腺中具有较高的水平,而在肝脏和肌肉中的水平较低。Real-time PCR检测表明,鲤鱼各组织MHC IIβmRNA水平在鲤鱼经过鳗弧菌浸泡刺激后发生变化,整体呈现先升高后下降、最后恢复到正常水平的趋势,其中脾脏和前肠在刺激后72 h达到最大值,分别可达到正常水平的6.5倍和4倍,而头肾和后肠在刺激后6 h就达到最大值,分别约为正常水平的7.5倍和6倍。原核表达结果表明,IPTG诱导2 h后,融合蛋白开始表达,之后表达量逐渐升高,至8 h时达到最大比例,稳定至14 h后又逐渐下降。将大量表达并纯化后的原核蛋白免疫新西兰雄兔,得到了多克隆抗血清,免疫琼脂双向扩散测得抗血清的效价为1∶32,蛋白质印迹分析结果显示该抗血清能够与原核表达的鲤鱼MHC IIβ融合蛋白特异性结合。构建了真核重组质粒pcDNA3.1/MHC II B,利用基因免疫的方法制备了鼠多克隆抗血清,免疫琼脂双向扩散测得抗血清的效价为1∶1 6,蛋白质印迹分析结果显示该抗血清能够与原核表达的鲤鱼MHC IIβ融合蛋白特异性结合。制备了鲤鱼前肠、后肠组织的石蜡切片,HE染色显示各组织结构清晰完整;采用制备的鼠抗鲤鱼多克隆抗血清进行免疫组化实验,发现鲤鱼MHC IIβ分子在各种免疫细胞,如淋巴细胞和巨噬细胞中具有表达,同时,在前肠和后肠上皮细胞中,也具有较高的表达,说明鲤鱼黏膜上皮细胞可能也具有递呈抗原的作用。