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第一部分 制备联合负载盐酸吉西他滨与顺铂的静电纺丝纳米缓释材料并探究其在体外的药物释放行为[目的]制备联合负载盐酸吉西他滨与顺铂的静电纺丝纳米缓释材料并探究其在体外的药物释放行为。[方法]采用经典静电纺丝技术,以聚乳酸为原料、六氟异丙醇为溶剂制备空白静电纺丝做为对照组。随后通过小鼠膀胱癌细胞系MB49的MTT实验,绘制盐酸吉西他滨和顺铂的药效曲线,并根据药理学原理,利用药效曲线计算出盐酸吉西他滨与顺铂联用时的最适药物剂量比。根据最适药物剂量比,以聚乳酸、盐酸吉西他滨和顺铂为原料,六氟异丙醇和二甲基甲酰胺为溶剂,制备联合负载盐酸吉西他滨与顺铂的静电纺丝纳米缓释材料。利用扫描电镜观察静电纺丝纳米纤维的直径分布和表征。利用氯仿完全溶解一定质量的静电纺丝纳米缓释材料,然后通过萃取技术和高效液相色谱技术检测氯仿溶液中盐酸吉西他滨的质量,并进一步计算静电纺丝纳米缓释材料的药物负载率。以生理盐水模拟体内组织液,将静电纺丝纳米缓释材料放入生理盐水中置于37℃恒温摇床内,并在不同时间点取少量溶液作为样本,利用高效液相色谱技术检测不同时间点的样本溶液中盐酸吉西他滨的浓度,根据检测结果绘制静电纺丝纳米缓释材料的药物释放曲线。[结果]根据MTT实验结果,我们绘制了盐酸吉西他滨和顺铂的药效曲线;利用药效曲线计算出盐酸吉西他滨的半数抑制浓度为0.4596mg/L,顺铂的半数抑制浓度为0.2347mg/L;因此,根据药理学原理计算出盐酸吉西他滨与顺铂在静电纺丝缓释系统中最适负载比例约为2:1。通过多次预实验,利用静电纺丝技术成功制备联合负载盐酸吉西他滨与顺铂的静电纺丝纳米缓释材料。在扫描电镜下可以观察到:静电纺丝缓释材料中的纳米纤维直径分布均匀、表面光滑、无明显串珠缺陷、相互交错成网状结构。在纳米纤维直径定量分析中,空白材料和缓释材料的纤维平均直径分别为0.8770±0.2299和0.3587±0.1264 um,两种材料纤维直径分布均匀并处于纳米级。通过重复10次的萃取,测定了溶解液中盐酸吉西他滨的总质量为4.188ug,并以此计算出缓释材料的载药率约为93.7%。利用高效液相色谱技术,成功绘制了缓释材料的药物释放曲线;从曲线中可以观察到:盐酸吉西他滨的累积释放量从0小时到8小时内迅速增加,纳米缓释材料溶解8h后达到溶解平衡;当达到溶解平衡时,盐酸吉西他滨的浓度约为0.295ug/ml,此时还有大量缓释材料尚未溶解。[结论]通过静电纺丝技术能够成功制备表征和直径分布良好的联合负载盐酸吉西他滨与顺铂的纳米缓释材料;制备成功的纳米缓释材料具有良好的药物负载率、持续的药物释放能力和缓释特性。第二部分 探究联合负载盐酸吉西他滨与顺铂的静电纺丝纳米缓释材料在实体瘤切缘阳性中的局部化疗效应[目的]探究联合负载盐酸吉西他滨与顺铂的静电纺丝纳米缓释材料在体外的抗肿瘤效果和在实体瘤切缘阳性中的局部化疗效应。[方法]在六孔板中培养小鼠膀胱癌细胞系MB49和乳腺癌细胞系4T1-luc,将六孔板随机分为四组,并给于不同处理:空白对照组（Control group:不予处理）、阴性对照组（PLA group:空白材料处理）、实验组（PLA-drug group:载药缓释材料处理）和阳性对照组（Drug group:直接给于化疗药物溶液处理）,在分组处理1天、2天、3天后,利用细胞流式术检测细胞凋亡率,利用WB检测细胞凋亡标志物Caspase3的表达,以探究静电纺丝纳米缓释材料在体外的抗肿瘤效应。利用外科手术在膀胱癌小鼠模型和乳腺癌小鼠模型中切除肿瘤体积的四分之三,以模拟肿瘤的切缘阳性;然后将两种动物模型各随机分成四组并给予不同处理（分组和处理同上述细胞实验,其中Drug group采用腹腔给药）,在分组处理3周后,通过小动物荧光成像技术、肿瘤体积监测和Tunel凋亡荧光染色技术,探究纳米缓释材料实体瘤切缘阳性中的局部化疗效应。[结果]在小鼠膀胱癌细胞系MB49的体外实验中,分组处理3天后PLA-drug组细胞凋亡率达到与Drug组相同的水平,两组的凋亡率分别为48.8%和42.2%,显著高于Control组和PLA组。随着处理时间的增加PLA-drug组细胞Caspase3的表达持续下降,在处理3天后,Caspase3在PLA-drug组的表达低于Drug组（P=0.046）。在乳腺癌细胞系4Tl-luc的体外试验中也呈现了相似的结果:分组处理3天后PLA-drug组和Drug组的凋亡率分别为30.6%和27.1%。在小鼠乳腺癌动物模型的体内实验中,通过小动物荧光成像显示肿瘤生长情况,结果显示:在分组处理2周后,PLA-drug组与PLA组相比较、Drug组与Control组相比较荧光强度均存在显著的统计学差异（P1=0.022,P2=0.035）,PLA-drug组与Drug组荧光强度也存在显著统计学差异（P=0.038）。通过缓释材料给药组的肿瘤荧光强度比腹腔给药组更低,这表明缓释材料组和腹腔给药组均具有良好的治疗效果,且缓释材料组比腹腔给药组治疗效果更好。在术后3周肿瘤的大体观标本体积测量中出现了相似的结果:PLA-drug组与PLA组相比较、Drug组与Control组相比较,肿瘤体积均存在显著的统计学差异（P1<0.001、P2=0.021）,但PLA-drug组与Drug组肿瘤体积的差异不具有显著性。在小鼠肿瘤组织切片的Tunel凋亡荧光染色中,能够观察到PLA-drug组的细胞凋亡区域的面积比例显著大于PLA组（P<0.001）、Drug组的显著大于Control组（P<0.001）。在膀胱癌小鼠模型中,缓释材料组肿瘤体积表现出了相似的实验结果:在术后3周,PLA-drug组与PLA组相比较、Drug组与Control组相比较,肿瘤体积均存在显著的统计学差异（P1=0.012、P2=0.008）;在 PLA-drug 组与 Drug 组之间也存在显著差异（P=0.041）。[结论]联合负载盐酸吉西他滨与顺铂的静电纺丝纳米缓释材料在体外对膀胱癌与乳腺癌细胞系具有良好的杀伤效果,在体内能够显著抑制小鼠肿瘤切缘阳性模型中残瘤的生长;其对残瘤的控制效果比腹腔直接给药效果更好。第三部分 探究静电纺丝纳米缓释材料局部给药的方式对肿瘤免疫微环境的影响和对全身化疗副作用的改善情况[目的]探究静电纺丝纳米缓释材料局部给药的方式对肿瘤免疫微环境的影响和对全身化疗副作用的改善情况。[方法]如上所述通过切除肿瘤体积的四分之三,建立小鼠乳腺癌肿瘤切缘阳性的动物模型。将动物模型小鼠各随机分成四组并给予不同处理（分组和处理同上述第二部分实验）,在小鼠分组处理3周后,采集小鼠血液样本以检测肝、肾功能和血常规。采集小鼠肿瘤、肝脏、肾脏和血液样本,通过超高效液相色谱-串联质谱法检测小鼠肿瘤、肝脏、肾脏和血液样本中盐酸吉西他滨的药物累积浓度。将采集的肿瘤样本进行固定、包埋和切片,通过双标荧光染色共定位技术鉴定各组小鼠肿瘤组织中骨髓来源抑制细胞（MDSCs）的分布,并通过免疫组化检测小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞、NKp46+NK细胞的分布;然后通过WB检测肿瘤组织中血管生长相关蛋白Flk-1、MMP9和VEGF的表达,通过CD34免疫组化显示肿瘤组织中血管生长状况。[结果]在肝功能指标中,PLA-drug组小鼠相比于Drug组小鼠的AST指标显著更低（272.08±34.57 VS 186.76±18.09,U/L;P=0.019）,Control组小鼠的ALT、AST均显著高于PLA组,这应该与Control组部分小鼠存在肿瘤肝转移相关,并从之前的小动物成像中得到了验证。在肾功能指标中,PLA-drug组小鼠相比于Control组小鼠的BUN 指标显著更低（55.52±7.238 VS 21.76±3.443,mg/dl;P=0.014）。在血常规指标中,PLA-drug组小鼠相比于Drug组小鼠的RBC和PLT指标显著更高（5.53（5.175,5.73）VS 6.8（6.595,6.920）,1012/L;P=0.031）、（416（390,491.5）VS 751（735,849.5）,109/L;P=0.019）,且与Control组、PLA组小鼠的RBC和PLT指标十分相似。超高效液相色谱-串联质谱结果显示:Drug组的肝脏、肾脏和血清样本中盐酸吉西他滨的含量均显著高于 PLA-drug 组,肝脏:（1509.97±176.42 VS 813.48±90.71,pg/g;P<0.001）、肾脏:（502.39±55.41 VS 235.52±34.93,pg/g;P<0.001）、血清:（1729.06±126.33 VS 1208.02±88.73,pmol/L;P<0.001）;而Drug组的肿瘤样本中盐酸吉西他滨的含量只有PLA-drug组盐酸吉西他滨的含量的八分之一（832.93±79.14 VS 6993.01±337.08,pg/g;P<0.001）。双标荧光染色共定位结果显示:在PLA-drug组荧光图片中,MDSCs细胞数量明显少于其他3组,而Drug组的荧光图片中MDSCs细胞的数量与Control组并没有显著差异。荧光组化检测结果显示:PLA-drug组肿瘤内CD8+T细胞显著高于Drug组（P=0.013）,PLA-drug组肿瘤内NK细胞显著高于Drug组（P=0.032）。WB结果显示PLA-drug组小鼠肿瘤组织中的Flk-1、MMP9和VEGF蛋白的表达量,相对于其他3组均显著减少;CD34免疫组化显示PLA-drug组小鼠肿瘤组织中微血管的分布显著低于其他3组。[结论]通过静电纺丝纳米缓释材料进行局部给药的方式,能够显著提高给药效率、减少药物在正常器官的累积、减少全身化疗引起肝肾功能和造血功能的损伤;静电纺丝纳米缓释材料的局部化疗还能显著抑制肿瘤组织内的骨髓来源抑制细胞的分布和肿瘤微血管的形成,并能重新募集CD8+T细胞、NKp46+NK细胞进入肿瘤组织。研究结果提示了纳米缓释材料不仅能直接抑制肿瘤细胞的生长,还能够通过改善肿瘤微环境、调节自身免疫系统抗击肿瘤。