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组织工程材料包括三个基本要素:种子细胞(功能细胞)、支架材料(细胞载体)和生物活性分子(生长因子)。支架材料为种子细胞提供物理支撑并形成局部微环境。当支架材料植入到体内时,周围组织液中的蛋白质将首先吸附到支架表面,其次才发生细胞的粘附。因此,吸附的蛋白质层是细胞与材料相互作用的重要纽带。细胞一旦发生了特异性粘附,则会通过黏着斑和细胞骨架产生细胞牵拉力(CTF),并通过CTF向支架的传递去感知支架的力学性质。有研究表明,纤连蛋白在材料表面的蛋白吸附力(Fad)能够调控CTF向基底材料的传递进而调控干细胞对基底力学性质的响应。人体组织液中包含众多不同类型的蛋白质。认为,蛋白类型影响Fad大小以及Fad介导的CTF传递和干细胞分化。据此,本文以血液中最丰富的血清白蛋白(牛血清白蛋白,BSA)、重要的胞外基质蛋白Ⅰ型胶原(COL I)和纤连蛋白(FN)为模型蛋白,在构建Fad检测和调控平台的基础上,定量检测各模型蛋白的Fad大小;在此基础上,进一步以大鼠间充质干细胞(rMSCs)为模型细胞,研究COL I的Fad大小对CTF传递,进而对干细胞响应基底力学性质的影响。主要研究内容及结论如下:
(1)首先构建了无应力松弛的高弹性模量和有应力松弛的低弹性模量聚二甲基硅氧烷基底(PDMS),分别记为CH3-10和CH3-100;然后采用氧表面等离子体技术在PDMS表面构建了富含-OH的自组装单分子层(SAMs),进而采用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)对所得-OH表面进行改性,制备富含-NH2的SAMs。采用水接触角测定仪、X射线光电子能谱和原子力显微镜检测结果证明CH3-、OH-、NH2-SAMs已成功构建,为后续调控和检测BSA、COL I和FN的Fad大小奠定了平台基础。
(2)采用平行板流动腔/微球技术定量测量了BSA、COL I和FN在OH-,NH2-和CH3-SAM表面的Fad。结果显示,BSA和FN的Fad呈现:-OH<-NH2<-CH3,而COL I则呈现-OH<-CH3<-NH2,表明表面化学可以调控蛋白的Fad。此外,在同一材料表面,Fad呈现:BSA<<FN<COL I,表明Fad具有明显的蛋白类型依赖性。
(3)通过免疫荧光染色、基底变形观察、碱性磷酸酶染色和油红O染色等手段考查COL I的Fad对CTF传递及干细胞行为的影响。结果显示,COL I在OH和NH2表面的高Fad使CTF可有效传递到基底,干细胞因能够感知基底的力学性质,包括弹性模量和应力松弛而在高弹性模量的刚性表面和应力松弛的软表面都趋于成骨分化。这不同于以往报道的rMSCs在预吸附FN的OH表面的分化:由于FN在OH表面的Fad过低,阻断了CTF向基底的传递,使rMSCs不能感知基底的力学性质,从而在软硬基底上都趋于成脂分化。
综上所述,本文通过定量检测不同类型蛋白质与基底间的Fad,发现了蛋白类型影响Fad大小,并且这不同的Fad会使CTF传递以及干细胞对基底力学性质的响应不同。这些发现不仅为验证Fad的重要性提供了更多的证据,而且为更全面地理解细胞-基底材料间的力传导机制并指导生物材料支架设计提供了新的策略。
(1)首先构建了无应力松弛的高弹性模量和有应力松弛的低弹性模量聚二甲基硅氧烷基底(PDMS),分别记为CH3-10和CH3-100;然后采用氧表面等离子体技术在PDMS表面构建了富含-OH的自组装单分子层(SAMs),进而采用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)对所得-OH表面进行改性,制备富含-NH2的SAMs。采用水接触角测定仪、X射线光电子能谱和原子力显微镜检测结果证明CH3-、OH-、NH2-SAMs已成功构建,为后续调控和检测BSA、COL I和FN的Fad大小奠定了平台基础。
(2)采用平行板流动腔/微球技术定量测量了BSA、COL I和FN在OH-,NH2-和CH3-SAM表面的Fad。结果显示,BSA和FN的Fad呈现:-OH<-NH2<-CH3,而COL I则呈现-OH<-CH3<-NH2,表明表面化学可以调控蛋白的Fad。此外,在同一材料表面,Fad呈现:BSA<<FN<COL I,表明Fad具有明显的蛋白类型依赖性。
(3)通过免疫荧光染色、基底变形观察、碱性磷酸酶染色和油红O染色等手段考查COL I的Fad对CTF传递及干细胞行为的影响。结果显示,COL I在OH和NH2表面的高Fad使CTF可有效传递到基底,干细胞因能够感知基底的力学性质,包括弹性模量和应力松弛而在高弹性模量的刚性表面和应力松弛的软表面都趋于成骨分化。这不同于以往报道的rMSCs在预吸附FN的OH表面的分化:由于FN在OH表面的Fad过低,阻断了CTF向基底的传递,使rMSCs不能感知基底的力学性质,从而在软硬基底上都趋于成脂分化。
综上所述,本文通过定量检测不同类型蛋白质与基底间的Fad,发现了蛋白类型影响Fad大小,并且这不同的Fad会使CTF传递以及干细胞对基底力学性质的响应不同。这些发现不仅为验证Fad的重要性提供了更多的证据,而且为更全面地理解细胞-基底材料间的力传导机制并指导生物材料支架设计提供了新的策略。