背景:恶性肿瘤是对人类身体健康危害最严重的疾病之一。在2007年召开的第18届国际抗癌联盟大会上,世界卫生组织发表的一项研究报告表明,全球癌症状况将日益严重,今后20年新患者人数将由目前的每年1000万增加到1500万,因癌症而死亡的人数也将由每年600万增至1000万。在肿瘤治疗中,化学治疗是当今临床治疗肿瘤的重要手段之一,但由于目前大部分化疗药物对正常细胞和肿瘤细胞缺乏选择性,在杀伤肿瘤细胞的同时往往也会损伤人体的正常细胞。从而引起严重的不良反应及化疗反应率低,限制了其临床应用。因此提高药物的靶向性是提高化疗效果、降低药物的毒副反应的有效手段之一。所谓纳米（nm）即毫微米（millimic）,1nm=10^-9m（即十亿分之一米）,它所涉及的物质层次处于既非宏观又非微观的相对独立的中间领域——介观（mesoscopy）。当粒子尺寸进入纳水量级时,即具有量子尺寸效应、小尺寸效应、表面效应和宏观量子隧道效应,因而表面出若干新的不同于宏观物质的特性,诸如低熔点、高比热容、高膨胀系数、高反应活性、高扩散率、高强度、高韧性、奇特磁性以及极强的吸波性。纳米技术是一门崭新的技术,被国际上公认为21世纪最有前途的科学领域,近年来,纳米技术在医学领域的运用研究方兴未艾。在对疾病的影像学诊断、免疫学诊断、生物传感器诊断以及生物芯片诊断等方面诞生一些新的方法,使患者得到更为及时和准确的诊断。在治疗方面,研究发现,利用纳米级聚合物粒子作为新的药物传递和控释的载体,由于其超微小体积,可通过靶向定位及缓释作用进入人体的细胞内,对核酸、蛋白质等生命物质进行分子水平的治疗,不但提高了现有药物的疗效,同时也大大减少了其本身的不良反应。纳米药物的靶向作用根据其机制不同可分为三类:①主动靶向,将抗体或配体等特异性的靶向分子偶联至粒子表面而使药物定向分布到靶组织;②被动靶向,对载体的理化性质（大小、形状、亲水性、表面电荷和囊壁孔径等）进行控制和修饰可调控其在体内的分布和药物释放特性,或选用对机体各种组织和病变亲和力不同的纳米粒也可达到靶向的目的;③物理化学靶向,例如:利用体外局部磁场,以超顺磁性纳米粒为载体,在外加磁场作用下定向分布于预定的靶组织。通过改变纳米颗粒的体积、质量、电荷及亲疏水性等理化性质,可以减少抗肿瘤药物与非靶向器官、组织及细胞的非特异性相互作用,从而增加靶部位/非靶部位的药物比率,提高了抗肿瘤药物疗效的同时,降低了药物的毒副反应。因而纳米控释体系在医学领域,特别是在肿瘤的治疗方面得到了广泛的研究。例如用脂质体（liposome）包裹阿霉素（商品名:楷莱）,已经在临床上得到了应用,但脂质体本身有一定的毒性,且包封率低、稳定性差,因此,寻找更佳的载体材料是目前的一个研究热点。壳聚糖（Chitosan,CS）是一种广泛存在于自然界的聚阳离子多糖衍生物,又称可溶性甲壳质、甲壳胺、几丁聚糖等,由D-氨基葡萄糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖组成,是以β-（1,4）糖苷键连接起来的直链多糖,化学名为（1,4）2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖,其结构类似于纤维素。壳聚糖无毒,具有良好的生物相容性和可降解性,由于其带正电性,使其在液念介质中可与带负电荷的聚合物、大分子甚至一些聚阴离子相互作用,由此发生的溶胶-凝胶转变过程则可方便地用于载药纳米微粒的制备;从生物药剂角度来看,壳聚糖纳米微粒具有附着在生物体黏膜表面的特性,这使得它尤其适用于黏膜药物的靶向输送。利用壳聚糖制备化疗药物、胰岛素、抗生素等药物的缓释、控释制剂及血脂吸附微球已取得较好的效果,部分已应用于临床,但在实际应用中却发现,普通载药纳米粒在血管中容易被网状内皮系统（RES）迅速摄取并清除而难以达到预期效果,如果在普通纳米粒表面通过物理吸附或共价结合一层或多层亲水性聚合物,如聚乙二醇（PEG）,则可形成蘑菇状、毛刷状或烙饼状位阻层,从而阻止血浆蛋白调理素接近壳聚糖,降低血浆蛋白与壳聚糖之间的范德华引力,使壳聚糖纳米粒可逃避体内单核细胞吞噬系统的捕获,延长纳米粒及其携带药物的血液循环时间,故称为“隐形”纳米粒（stealth nanoparticles）,克服了传统纳米粒在体内大部分迅速被网状内皮系统（RES）所吞噬,难于到达其他肿瘤组织的缺点,从而延长在体内循环的时间,通过肿瘤靶向治疗机制——增强的渗透性和保留效应,完成对肿瘤组织的靶向作用。本研究我们选用CS作为原材料,采用阴离子凝聚法制备出包裹有抗癌药物的载药纳米粒,并用聚乙二醇修饰,检测其表征,通过体外细胞毒试验和体内抑瘤试验,探讨其对肿瘤细胞增殖的抑制作用,以期为临床应用提供理论依据。目的:1.探讨壳聚糖隐形纳米粒作为抗癌药物给药系统的可行性。2.制备普通壳聚糖纳米粒（CS NPs）和经聚乙二醇修饰的隐形壳聚糖纳米粒（PEG/CS NPs）,并分别负载模型药物表柔比星（EPI）,检测载药纳米粒的表征和体外释药性能。3.观察载药纳米粒在体外对肿瘤细胞的增殖抑制作用,证明壳聚糖载药纳米粒与游离药物同样具有抗肿瘤效应,进一步证明壳聚糖纳米粒能够给对药物起到缓释作用。4.对移植瘤小鼠进行体内抑瘤试验,证明载表柔比星的壳聚糖隐形纳米粒较普通纳米粒具有更好的体内抑瘤作用,更适合作为化疗药物的载体。方法:1.利用PEG上带负电的氧基与壳聚糖上带正电的氨基通过分子间氢键结合,再应用阴离子凝聚法制备经PEG修饰的载药纳米粒,透射电镜观察纳米粒的形态特征,激光粒度分析仪测定粒径大小及分布,紫外分光光度法测定纳米粒的载药量,动态透析法考察载药纳米粒的体外释放特性。2.体外培养5-8F鼻咽癌细胞,通过MTT法测定和研究不同浓度的载药纳米粒、空白纳米粒和游离药物与肿瘤细胞共培养4、48、72h后对细胞的增殖抑制率,并推算当细胞生长抑制率为50%时的所需药物浓度,即IC₅₀值。3.制备S-180实体移植瘤小鼠,采用尾静脉注射方法给药,设隐形载药纳米粒、普通载药纳米粒、游离药物和生理盐水四组,给药后一周处死小鼠,剥离瘤体、称重,计算抑瘤率。4.采用SPSS13.0统计软件处理数据,所有数据用均数±标准差（x±s）表示,体外细胞增殖抑制试验采用重复测量数据的统计分析;体内抑瘤试验采用选用one-way ANOVA,经Levene方差齐性检验后,采用Dunnett’s法进行多重比较,以P＜0.05表示差异具有显著性。结果:1.按CS/TPP质量比为6:1,CS/EPI质量比为8:1时,制备的载药纳米粒呈圆形或椭圆形,分散性良好,平均粒径322nm,载药量为13.9±1.1%,包封率74.2±1.8%,72小时累积释药率达82%。2.载药壳聚糖纳米粒在体外对5-8F鼻咽癌细胞株的增殖抑制作用具有浓度和时间依赖性,随药物浓度的增大和作用时间的延长,抑制率逐渐提高,而空白纳米粒仅在高浓度时对细胞生长有一定的抑制作用。3.载表柔比星的隐形壳聚糖纳米粒组、载表柔比星的普通壳聚糖纳米粒组和游离表柔比星组抑瘤率均显著高于生理盐水对照组（P＜0.05）;与游离药物组比较,壳聚糖纳米粒包封提高了药物的抗肿瘤作用（P＜0001）,与普通壳聚糖纳米粒组相比,隐形壳聚糖纳米粒组的抑瘤作用更强（P=0.023）。结论:1.采用阴离子凝聚法制备的壳聚糖载药纳米粒形状规则、粒度分布均匀、具有较高包封率和较好缓释性能。2.载药隐形壳聚糖纳米粒对荷S-180移植瘤小鼠的体内抑瘤作用强于普通载药壳聚糖纳米粒,隐形壳聚糖纳米粒更适合作为化疗药物的新型载体。