肝功能衰竭是各类重型肝炎和晚期肝硬化患者的主要死因，虽然，肝移植术已明显改善了肝功能衰竭患者的预后，但是由于健康供肝短缺及昂贵的价格，该项手术在未来数年内还难以在国内外普遍开展。生物人工肝支持治疗技术和肝细胞移植的兴起，为许多肝功能衰竭患者带来了新的希望，许多学者成功地应用肝细胞移植或肝细胞为基础的生物人工肝治疗了严重的肝衰竭及晚期代谢性肝病患者，研究表明原代肝细胞是肝细胞移植和生物人工肝最理想的生物材料。 离体培养的肝细胞在短期内形态和功能会发生明显变化，为了了解这些变化，探讨其短期内培养的最佳功能状态，为临床进行肝细胞移植和生物人工肝治疗提供实验依据，我们采用Seglen报道的改良二步胶原酶灌流法并略加修改进行大鼠肝细胞的分离及纯化，获取的肝细胞在含有多种辅助因子的Williams’E培养基中进行单层培养。通过台盼蓝排斥法计算细胞产量和细胞活率；MTT比色法检测连续培养8d肝细胞的活力；光镜、HE染色以及SABC免疫组化方法动态观察细胞形态学改变，透射电镜观察其超微结构；用细胞化学方法测定G-6-Pase活性；并收集不同时期培 第四军医大学硕士学位论文养上清检测肝细胞白蛋白分泌、尿素合成功能及LDH漏出量。结果显示平均每只大鼠肝可获取 1二 1土 0．45 XIO’个肝细胞，平均活力为 93石土 2．8％。MTT实验结果显示肝细胞培养第 3d A值较高，细胞活力处于最佳状态。光镜下可见肝细胞呈多角形生长，有双核，连接成片状或岛状，能存活3周左右。HE染色显示细胞清晰，胞浆红染、胞核呈蓝色，可见双核。透射电镜下可见大量内质网、车轮状线粒体、糖原颗粒、细胞紧密连接及胆小管等肝细胞特征性结构。免疫组化结果显示细胞角蛋白18阳性表达。镜下观察表达G－6－Pase的肝细胞阳性表达，细胞胞浆呈棕黑色颗粒。肝细胞功能检测显示LDH漏出量、白蛋白分泌及尿素合成功能在1周内出现波动性变化，第 3d LDH漏出量最低，白蛋白分泌及尿素合成功能在第3、4d时较好。 肝细胞移植已开始用于临床，并取得了一定的疗效，但用于移植肝细胞的最佳状态和适宜时机，目前还不太清楚。为此我们用剂量为2刀g／kgD－氨基半乳糖制备大鼠急性肝衰模型，24h后随机分为3组进行肝细胞移植治疗，1 组：经脾内移植体外培养3d的肝细胞：11 组：经脾内移植预孵育 sh的肝细胞悬液 IX 10’；Ill 组：经脾内注射生理盐水 lml。连续2周观察移植后大鼠存活率，自动生化分析仪检测肝脏生化指标（ALT、AST、TBil），HE、PAS染色观察肝脏组织学及移植后脾内肝细胞的生物学特性，以比较体外短期培养的肝细胞和新分离的肝细胞悬液经脾内移植治疗急性肝衰竭大鼠的疗效，为探索移植肝细胞的最佳状态和适宜时间提供实验依据。资料显示，I组、11组大鼠存活率阿8％，71％）与Ill组大鼠存活率＊3％）相比具有显著性差异（尸＜0．of，尸t 0．05人 各项肝功能指标均有明显改善，肝组织病理改变较轻。但1组与＊组大鼠的存活率、肝功能等方面比较，没有显著性差异。经HE和PAS染色证实，移植的肝细胞在受体脾内结构和功能保持较好。 ．4． 第四旱医大学硕士学位论文 本研究结果表明：1、体外原代培养的大鼠肝细胞的形态和功能具有一致性，原代大鼠肝细胞在培养第3、4d功能较好，可能为肝细胞移植和生物人工肝应用的最佳时机。2、采用又刀g／kgr氨基半乳糖，腹腔注射24h后作为制备大鼠急性肝衰竭模型的最适药物剂量和最佳时间。3、经脾内移植的体外短期培养肝细胞和肝细胞悬液均能提高大鼠药物性肝衰竭的存活率、改善肝功能及肝脏组织病理变化。两组移植细胞比较，虽然在上述移植治疗效果上无显著差异，但培养肝细胞似优于孵育sh肝细胞。 以上结果为异体肝细胞的分离、最佳功能状态及应用时机的判定提供了实验依据。