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C-反应蛋白(C-reactive protein CRP)是血清中的一种微量蛋白质,最初因其能够沉淀肺炎双球菌细胞壁上的C多糖而得名,这也是首次对CRP的描述。CRP是急性期反应蛋白中的一种,机体正常时血清中含量非常低,但是当机体受到组织损伤时,血清中CRP水平会迅速增加,增加的幅度与刺激强度成正比。CRP指标还可以用于鉴别犬的细菌感染和病毒感染,从而指导抗生素的使用。在人类临床医学中,CRP已经成为了像白细胞和红细胞计数那样的常规检测指标之一,但是在兽医临床中CRP检测技术还没有得到运用。本实验克隆犬CRP基因,成功建立了犬pEASY-El-CRP表达载体。诱导表达了重组的CRP,并纯化其重组表达蛋白。用亲和层析法得到犬血清中的天然CRP。制备并纯化了兔抗犬融合CRP和天然CRP的多克隆抗体,比较了两者的免疫原性。用兔抗犬天然CRP多抗建立了免疫透射比浊定量检测方法,为兽医临床中犬CRP检测技术的运用奠定基础。本实验克隆得到犬CRP基因,建立原核表达载体,纯化了表达的融合的CRP。克隆的犬CRP cDNA全长672bp,由223个氨基酸组成,前1-19个氨基酸组成信号肽,第19-20个氨基酸为信号肽与主蛋白的分割剪切点。在所有组成的氨基酸当中21.97%为α-螺旋结构,由49个氨基酸构成。32.74%为延伸链,由73个氨基酸构成。4.9%为p转角,由11个氨基酸构成。40.36%为无规则卷曲,由90个氨基酸组成。该氨基酸序列包含1个N-糖基化位点,糖蛋白质中的一种。该氨基酸序列包含2个蛋白激酶C磷酸化位点。还有1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,以及1个酪氨酸激酶磷酸化位点和2个N-十四酞基位点。将本实验获得的犬CRP基因序列和NCBI GenBank中已登录的犬CRP基因进行对比,序列同源性为99%。构建了pEASY-El-CRP表达载体,用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了诱导表达后的重组蛋白,在25kDa处有较深的目的条带与软件预测的大小24.64kDa相符合。纯化后重组蛋白经SDS-PAGE和Western blotting检测,在25kDa处均有单一清晰条带。给犬皮下注射松节油,得到急性期犬血清,采用亲和层析法纯化血清犬CRP。经SDS-PAGE检测,25kDa处有明显的目的条带。进一步制备兔抗犬血清CRP和兔抗犬融合CRP的多克隆抗体。对纯化后的多抗进行鉴定,SDS-PAGE电泳结果显示两者的多抗在55kDa和25kDa处均有较深的目的条带。免疫印迹实验结果显示出现明显的条带,但天然CRP多抗的条带更加明显。ELISA法检测两者抗体的效价,其滴度分别为1：2048和1：1024。利用兔抗犬天然CRP多抗建立了免疫透射比浊定量检测方法。方法学评价试验结果表明研制的试剂稳定性较好,不同的样本进行的批内和批间重复性较好。实验组与的对照组存在显著的差异,P<0.01。