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水产品中呋喃唑酮的残留具有致癌、致畸、致突变作用,对于人类的健康构成极大的危害。因此,研发具有自主知识产权的快速、准确、灵敏的呋喃唑酮免疫检测技术具有重要的意义。本实验提取小鼠杂交瘤细胞总RNA,并逆转录合成第一链cDNA,利用抗体可变区简并引物扩增全套重、轻链可变区基因VH-linker、linker-VL,经重叠PCR合成VH-linker-VL型单链抗体基因。包被用重氮法偶联成的FZD-OVA作为筛选抗原,通过核糖体展示技术筛选特异于呋喃唑酮的单链抗体,将筛选到的单链抗体基因进行表达、纯化,并研究其特异性与亲和力,建立了基于单链抗体的呋喃唑酮间接竞争ELISA检测方法。主要研究结果如下:(1)采用重氮法制备偶联抗原,对偶联产物进行紫外扫描检测和HPLC分析,结果表明呋喃唑酮和蛋白载体偶联成功。(2)提取小鼠杂交瘤细胞RNA,经RT-PCR构建的单链抗体文库,轻链片段的大小为600 bp左右,重链片段的大小为400 bp左右,经连接肽连接后得到的完整的单链抗体大小约为1 kb,对其进行测序分析,结果表明成功构建完整的单链抗体基因片段。(3)将构建的ScFv文库经体外转录翻译后,用FZD-OVA对产生的ARM三元复合体进行亲和筛选,经过洗涤后能够特异性结合的三元复合体被保留下来,回收复合体解离后释放的mRNA,进行RT-PCR扩增获得筛选后的单链抗体文库,重复上述过程,获得经过三轮筛选后的ScFv文库。(4)将经过三轮筛选的ScFv文库与表达载体pET-28a(+)连接后,转入大肠杆菌中表达。然后通过间接ELISA分析单链抗体与FZD-OVA的结合活性。经过三轮筛选后的文库中随机挑取的克隆子有20%与FZD-OVA有较好的结合能力,并获得1株高亲和的单链抗体FZD-ScFv1,用于下一步的表达、纯化及分析。(5)建立基于单链抗体的呋喃唑酮间接竞争ELISA检测方法。FZD单链抗体在浓度为10～100 ng/mL范围具有较好的线性,IC50值为13.01 ng/mL,最低检测限为1.28 ng/mL,对于其他硝基呋喃类抗生素及其代谢物均不存在交叉反应。该方法重现性较好,平均误差为3.83%。样品的加标回收率为73.38～84.52%,变异系数为6.81～9.41%。