1.研究背景：大肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,除少数患者能早期发现并进行手术根治切除外,大部分中晚期患者均需要化疗。当前临床上最常用的化疗方案如奥沙利铂(OXA)加5-氟尿嘧啶(5-FU)的FOLFOX方案治疗转移性晚期大肠癌缓解率为31-56%,中位生存期约为2年。但是,大部分肿瘤化疗后最终会产生耐药,重新进展,表明化疗药物并不能完全有效的杀灭所有肿瘤细胞,因此有效识别并清除这些残留的肿瘤细胞是根治大肠癌的关键。近年的研究结果证实,肿瘤是一群异质性很强的细胞组成,其中肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells, CSCs)是肿瘤形成的始发细胞。CSCs类似正常干细胞具有数目少、通常处于静止状态、及自我更新能力等特点。目前已分别在白血病及实体肿瘤如脑、肺、乳腺、胰腺、大肠、肝脏等恶性肿瘤中成功分离出CSCs;而且发现CSCs表达相对特异的标志物,同时表达两个或两个以上的标志物较单一表达具有更强的干性；还证明这些CSCs对常规化疗药物耐药,易在化疗后出现明显富集,导致肿瘤的复发与转移,是化疗药物治疗失败的主要原因。有研究显示多数肿瘤干细胞包括大肠癌干细胞对化疗药物耐药与其高表达ABC转运蛋白超家族、高效的DNA修复和抗凋亡特性等多种机制有关。ABC转运蛋白是一类包括ABCB1、 ABCC1、 ABCG2等成员的ATP依赖型外排泵,通过将有害物质(包括细胞毒药物)排出细胞外、降低其胞内浓度达到保护自身作用,而许多大肠癌临床标准化疗药物都需通过作用在细胞核中的DNA或相关的酶而发挥细胞毒性。另外,某些已证实具有抗肿瘤(干)细胞作用的天然产物如姜黄素,尽管有较强的体外抗肿瘤特性,但由于其高疏水性、体外不稳定性及较差的药代动力学,极大地阻碍了该产物在体内的疗效,因此,针对目前大肠癌治疗中遇到的困境,如何弥补现有药物的相关缺陷,从而有效地杀伤CSCs,是当前抗肿瘤药物研究的难点。纳米药物输送系统的研发是纳米医学发展的重要方向,也为解决上述这些难题提供了新手段,更为药效佳但毒性大或水溶性差的活性药物提供可能。聚合物纳米胶束两亲性的接枝或嵌段共聚物,通过自聚集,形成具有核-壳结构,为抗肿瘤药物的输送至相关作用靶点提供了有效的载体,而且,聚合物纳米胶束可通过“增强渗透与保留作用”(EPR效应)将药物积累在肿瘤组织中。其中硬脂酸-壳寡糖(CSO-SA)胶束由于其组织相容性和可代谢性,已被广泛地用作聚合物药物载体。CSO来源于脱乙酰壳多糖的酶降解,是无毒,低免疫原性和生物可降解性的。SA也是细胞毒性很低,因为它主要是脂肪分子组成。已有研究表明,CSO-SA胶束用来作为荷载抗癌药物的载体具有促进肿瘤细胞摄取作用,经过表面基团的修饰,可作为亚细胞靶向载体将药物输送至细胞浆或细胞核,甚至特定细胞器中。前期工作已证明CSO-SA载药胶束具有良好的体内抑瘤效果和逆转肿瘤细胞多药耐药(MDR)作用。因此,如何有效的利用现行已经证实具有抗肿瘤的活性药物如化疗代表药奥沙利铂和中药单体姜黄素为模型,通过新型的CSO-SA纳米药物输送系统来提高肿瘤细胞内药物浓度,从而有效的杀灭肿瘤干细胞,降低药物毒副作用,最终达到增强抗肿瘤效果,是具有应用前景的新研究领域,有待深入探索。2.研究目的：本课题组与胡富强教授实验室合作(浙江大学药学院),整合了前期工作中已经建立的较为稳定成熟的壳寡糖硬脂酸纳米胶束(CSO-SA)靶向药物输送技术以及大肠癌干细胞研究平台。研究利用了CSO-SA胶束具有独特的疏水性内核-亲水性外壳结构特点,将疏水性内核作为难溶性药物的储库,亲水性外壳则维持胶团在水溶性介质的稳定性。通过改造现有的化疗药物如以奥沙利铂为模型,和中药单体如以姜黄素为模型,制备成不同载药成分的新型的复合纳米胶束。通过糖脂纳米胶束可以被动靶向到肿瘤部位的特性,将药物在肿瘤组织内实现大量聚集,并限制药物效应在肿瘤组织中,在提高对肿瘤组织杀伤力的同时,也减少对正常组织的损伤,克服大肠癌干细胞化疗后富集和耐药,达到同时杀灭大肠癌干细胞和普通肿瘤细胞的目的,是一项有创新意义的研究。3.研究内容：本研究通过制备壳寡糖硬脂酸纳米胶束(CSO-SA)载化疗药物如以奥沙利铂(oxaliplatin, OXA)为模型,和中药单体如以姜黄素(curcumin, Cur)为模型,分别评价其抗大肠癌干细胞的药效学作用。3.1CSO-SA/OXA胶束的制备及抗大肠癌干细胞药效学研究：研究方法1)壳寡糖硬脂酸纳米胶束(CSO-SA)的合成及其理化性质评价：以CSO(18kDa)和SA (C18H36O2)为原料,采用碳二亚胺为交联偶合剂,合成CSO-SA胶束。三硝基苯磺酸法测定CSO-SA胶束的氨基取代度；芘荧光法测定CSO-SA的临界胶束浓度(主要由胡富强实验室完成)。2)壳寡糖硬脂酸纳米胶束载奥沙利铂(CSO-SA/OXA)胶束的制备及其理化性质评价：采用薄膜分析法制备CSO-SA/OXA胶束；耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定纳米药物中铂(Pt)的含量,计算载药胶束的载药量和包封率；透射电镜观察纳米粒子大小及形态。3) CSO-SA/OXA胶束杀伤大肠癌干细胞的体外实验：研究肿瘤细胞及肿瘤细胞球对CSO-SA/OXA胶束的摄取能力及作用部位；通过与OXA、CSO-SA胶束比较,利用MTS、无血清条件下细胞成球实验,评价CSO-SA/OXA胶束对大肠癌干细胞毒性效应。4) CSO-SA/OXA杀伤大肠癌干细胞的体内实验：裸鼠皮下成瘤后,OXA、空载体及CSO-SA/OXA胶束溶液尾静脉分别给药,评价CSO-SA/OXA胶束抗肿瘤作用的优越性：如抑瘤率、大肠癌干细胞比例、肿瘤细胞凋亡情况及对动物本身的毒性。研究结果：1) CSO-SA和CSO-SA/OXA胶束的合成及表征粒径分析表明,CSO-SA胶束的平均粒径为25.4nm,Zeta电位29.9mV；而OXA载入CSO-SA胶束后,平均粒径90nm,Zeta电位24.4mV。透射电镜下观察该纳米胶束具有规整的球形外观,在溶液中分散良好。CSO-SA/OXA胶束包封率(EE)的可达60wtt%。释放曲线显示：在48hr内,超过90%的OXA从CSO-SA/OXA胶束中释放,药物且能较平缓释放。2) CSO-SA/OXA胶束在体外能有效杀伤大肠细胞与CSCsMTS检测显示：CSO-SA/OXA胶束在体外能有效杀伤大肠癌细胞与大肠癌CSCs；无血清条件下可有效的抑制大肠癌细胞球的形成。3) CSO-SA/OXA胶束增强体内抗肿瘤的疗效和减少CSCs富集CSO-SA/OXA胶束显著的增强抗肿瘤疗效和减少体内CSCs富集,而且没有增加对小鼠本身的毒性；但作为对照的OXA在抑瘤的同时却导致CSCs的富集。4)CSO-SA/OXA胶束对肿瘤细胞和CSCs杀伤作用可能与其突出的细胞穿透能力,及提高药物在肿瘤组织和细胞核内的积累有关,具体机制有待进一步研究。结论：制备的CSO-SA/OXA胶束,具有优良的细胞摄取内化能力；在体外CSO-SA/OXA胶束可以同时杀灭大肠癌CSCs与非CSCs;在小鼠活体内,CSO-SA/OXA胶束能够有效抑制肿瘤的生长和CSCs富集。CSO-SA/OXA胶束增强抑瘤疗效,可能与复合纳米药物作用于细胞核,具有较高的细胞内药物累积及与胶束在肿瘤组织内有效缓释有关。3.2新型CSO-SA/Cur胶束的制备及抗大肠癌干细胞药效学研究：研究方法1)同3.1方法合成CSO-SAo2)CSO-SA/Cur胶束的制备及其理化性质评价：采用复合法制备CSO-SA/Cur胶束；荧光分光光度计测定姜黄素(curcumin, Cur)浓度,计算CSO-SA/Cur胶束的载药量和包封率；透射电镜观察CSO-SA/Cur胶束的粒子形态；以及CSO-SA/Cur胶束水溶性和稳定性检测。3) CSO-SA/Cur胶束对大肠癌干细胞作用的体外实验：肿瘤细胞对复合纳米药物的摄取能力评价；通过与空载体及游离姜黄素比较,评价CSO-SA/Cur胶束对大肠癌CSCs杀伤效应。4) CSO-SA/Cur胶束对大肠癌干细胞作用的体内实验：构建大肠癌动物模型,观察CSO-SA/Cur胶束在肿瘤的分布情况及对大肠癌CSCs的杀伤作用。研究结果：1) CSO-SA/Cur胶束的合成及表征：粒度分析表明,所得包裹了药物纳米胶束的平均粒径114.9nm,Zeta电位18.5mV,透射电镜下观察该纳米胶束具有规整的球形外观；而且重点考察了CSO-SA/Cur胶束的溶解性、稳定性,证实CSO-SA/Cur胶束室温条件下能溶解于水溶液,并且保持相对稳定。2)在体外,CSO-SA/Cur胶束抑制大肠癌细胞生长,效果较姜黄素DMSO溶液高4～6倍；CSO-SA/Cur胶束不但可抑制大肠癌细胞球的形成,而且杀伤大肠癌CSCs.3) CSO-SA/OXA胶束的体内实验表明：荷瘤鼠尾静脉给药14天后,与对照组相比,CSO-SA/Cur胶束能有效的抑制大肠癌移植瘤的生长,更可选择性的杀伤CSCs,且对小鼠体重无明显的影响。结论：我们已成功制备了新型CSO-SA/Cur胶束(已申请发明专利)。合成的CSO-SA/Cur胶束在水溶液中具有良好的溶解能力。而且,研究结果清楚地表明,在体外,CSO-SA/Cur胶束可以有效提高抗肿瘤效用,杀伤大肠癌CSCs.而CSO-SA/Cur胶束静脉给药不仅能够明显抑制肿瘤的生长,还可有效的杀伤CSCs,而且对活体的毒性较低。其机制除前述载体作用外,还可能与姜黄素本身就具有抗CSCs有关。4.总结：我们制备的CSO-SA/OXA和CSO-SA/Cur纳米胶束,具有良好的理化性质和细胞摄取内化能力。体内外实验均显示其明显的抗肿瘤作用,更可抑制CSCs富集或有效的杀伤CSCs,而且对活体的毒性相对较低,值得进一步研发。